威海地区食源性细菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立

摘要

目的：海洋性弧菌广泛分布于内湾、沿岸、外洋水域、海洋生物体和沉积物中，能够感染鱼类或哺乳动物，并可在人群中引起食物中毒。不少弧菌会导致人或其他动物发病，以霍乱弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌致病力最强。随着海产品消费的不断增多，因海产品传播的细菌性疾病发生范围和频率也逐渐增大。常规的海洋弧菌检测方法即培养法不能满足快速诊断的需要，且某些海洋性弧菌培养困难，因此建立病原性海洋弧菌的快速检测技术，对病原性海洋性弧菌感染的诊断、治疗和维护公共健康具有重要意义。本研究旨在了解威海地区食源性疾病中致病菌的分布情况，建立一种可以同时检测临床标本中创伤弧菌及副溶血性弧菌的多重降落PCR方法，为临床快速诊断创伤弧菌和副溶血弧菌感染提供一种有效手段。 方法：收集2017年3月～10月威海市立医院食源性疾病就诊患者的粪便标本357例，采用常规培养法结合质谱分析对标本中病原菌进行鉴定。设计针对创伤弧菌（Vibrio vulnificus）细胞溶解素编码基因vvhA和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）胶原蛋白酶编码基因col的特异性引物，建立单一降落PCR和多重降落PCR反应体系并进行优化，检测各种标准菌株和临床菌株评价单一降落和多重降落PCR的特异性和敏感性。应用多重降落PCR检测103例粪便标本中创伤弧菌和副溶血弧菌，并与细菌培养法结果进行比较，评价多重降落PCR在临床标本检测中的可行性。 结果：（1）共检出致病微生物98株，5种疾控要求监测病原微生物致泻大肠埃希菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、诺如病毒和志贺氏菌的比率依次为26.53%、21.43%、20.41%、10.20%和7.14%；另外还检出其它致病性海洋弧菌14株（14.28%），包括创伤弧菌6株（6.12%）、哈氏弧菌3株（3.06%）、溶藻弧菌3株（3.06）和灿烂弧菌2株（2.04%），海洋性弧菌的总检出比率为35.71%。（2）单一降落PCR只分别对创伤弧菌或副溶血弧菌检测到特异扩增条带，对其它种类弧菌和非弧菌未出现特异扩增条带；对创伤弧菌和副溶血弧菌的最低检测限分别为104CFU/ml和103CFU/ml。（3）多重降落PCR可在目标测试菌中同时检测到创伤弧菌和副溶血弧菌的特异性扩增条带，对其它种类弧菌和非弧菌未出现特异扩增条带；对创伤弧菌和副溶血弧菌的最低检测限亦分别为104CFU/ml和103CFU/ml。（4）与细菌培养法比较，多重降落PCR检测103份粪便标本中创伤弧菌的灵敏度和特异性分别为l00%和97.94%，副溶血性弧菌的灵敏度与特异性分别为100%和95.12%。 结论：（1）威海地区食源性疾病中海洋性弧菌检出率高，需要对其进行监测。（2）成功建立快速检测创伤弧菌和副溶血性弧菌的多重降落PCR方法，灵敏度高，特异性强，可直接用于临床标本中创伤弧菌和副溶血性弧菌的快速检测。

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