RNA干扰沉默RRS1基因对乳腺癌细胞MCF-7生物学行为的影响

摘要

目的:乳腺癌的发生发展受到多种多样因素的影响，且发病率逐年提高，是目前全球女性发病率最高的恶性肿瘤。乳腺癌的治疗方式仍较为传统和单一，目前分子靶向治疗成为临床研究热点，但是乳腺癌相关生物标志分子和分子靶点仍非常有限。为了筛查出有价值的乳腺癌相关因子，对乳腺癌成对样本信息通过高通量差异表达基因筛选和生物信息分析，成功筛选出一个新的对乳腺癌有重要作用的基因—核糖体合成调控因子（Regulator of Ribosome Synthesis1，RRS1）。通过检测RRS1基因在人的乳腺正常上皮细胞HMEC和乳腺癌细胞MCF-7中的表达差异，探讨RRS1基因与乳腺癌发生发展的相关性；通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制RRS1的表达后，分析RRS1对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖活力、细胞周期分布、凋亡及迁移能力的影响。 方法:采用Western blot方法检测RRS1在人乳腺癌细胞MCF-7与正常的人乳腺上皮细胞HMEC中是否存在表达差异；分别构建携带绿色荧光蛋白的shRNA-RRS1慢病毒和shRNA-Ctrl RNA阴性对照慢病毒干扰系统，分别感染乳腺癌MCF-7细胞，得到shRRS1实验组和shCtrl对照组；采用荧光定量PCR和Western blot分别检测两组细胞RRS1mRNA及蛋白表达水平，确定敲减效率；采用MTT法，连续6天检测两组细胞增殖活力；PI染色流式细胞术检测细胞周期变化；采用DAPI荧光染色、Annexin V-APC单染流式细胞术以及Caspase3/7实验从不同方面检测细胞凋亡情况；采用Transwell实验检测细胞迁移能力变化。 结果:经Western blot检测，RRS1基因在乳腺癌细胞MCF-7中的表达明显高于人正常乳腺细胞HMEC（P＜0.0001）。慢病毒感染后的细胞，与对照的shCtrl组细胞相比，shRRS1组RRS1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），说明构建的shRNA-RRS1慢病毒载体能有效抑制RRS1基因的表达；并且shRRS1组细胞活力显著减弱（P＜0.001），G1期细胞占比明显增加（P＜0.05）；且敲减RRS1表达后的细胞，发生典型的凋亡形态学改变，shCtrl对照组细胞核的荧光为均匀的亮蓝色圆形或椭圆形；shRRS1实验组大多数细胞核或细胞质内可见致密的浓染颗粒。Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测敲减后的细胞凋亡率显著增高（P＜0.001）；Caspase3/7试验检测，相对于shCtrl组，shRRS1组Caspase3/7活性明显增加，且差异具有显著性（P＜0.0001）。同时与未敲减shCtrl组相比，RRS1敲减后细胞迁移能力显著降低（P＜0.0001）。 结论:RRS1在乳腺癌细胞MCF-7中高表达；抑制RRS1基因的表达能明显引起乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力降低、凋亡增加以及细胞周期G1期阻滞，同时使得细胞迁移能力显著降低。提示RRS1与乳腺癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期进程有关。鉴于RRS1在核糖体合成及其他机制中的作用，因而本研究结果为乳腺癌的分子靶向治疗提供了新的研究思路。

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引言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1细胞株及主要试剂

1.2仪器

2 方法

2.1细胞培养与冻存

2.2 siRNA的序列设计

2.3慢病毒转染

2.4 荧光定量PCR检测mRNA表达水平

2.5 Western blot检测RRS1蛋白表达水平

2.6 MTT法检测细胞增殖能力变化

2.7 细胞周期检测

2.8 DAPI荧光法检测细胞凋亡

2.9 Annexin V-APC单染法测细胞凋亡

2.10 Caspase 3/7试验检测细胞凋亡状况

2.11 Transwell试验测细胞转移

2.12统计学分析

结果

1 MCF-7与HMEC中RRS1蛋白表达差异检测

2 细胞转染水平检测

3 敲减后RRS1基因转录与翻译水平检测

4 细胞增殖能力检测

5 流式细胞仪检测细胞周期

6 荧光染色检测细胞凋亡情况

7 流式细胞仪法检测细胞凋亡

8 caspase 3/7试验检测细胞凋亡

9 细胞迁移能力的变化

讨论

结论

参考文献

综述

综述参考文献

攻读学位期间的研究成果

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致 谢