金黄色葡萄球菌对人角质形成细胞Toll样受体2及β-防御素-3影响的研究

摘要

目的：目前国内对金黄色葡萄球菌（金葡菌）侵染人角质形成细胞的研究多集中在抗菌肽对金葡菌的抑制与杀伤作用等方面，而对染菌角质形成细胞产生的Toll样受体与β-防御素的相关研究较少。本实验通过建立金葡菌侵染人角质形成细胞（HaCaT细胞）的体外模型，来观察金葡菌对HaCaT细胞活力的影响，检测染菌细胞内Toll样受体2（TLR2）和β-防御素-3（hBD-3）的表达变化，初步探讨TLR2及hBD-3的免疫机制，来揭示皮肤感染金葡菌后的发病机制。 方法：将HaCaT细胞培养到80％融合时，用0.25％胰酶消化，加入培养液重悬，细胞计数，调整细胞浓度为0.5×104/ml进行接种；将金葡菌接种于平板，培养24h，拍照观察其生长状况，挑取单菌落接种于液体培养基，16～18h后收集菌体用培养基重悬，于分光光度计660nm处测定菌液OD值，算出菌液浓度（0.8004×109CFU/ml）。实验设空白对照组和MOI（感染复数=细菌量∶细胞量）分别为1∶20、1∶10、1∶1、3∶1、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1和200∶1的九个梯度的金葡菌处理组。将HaCaT细胞接种至96孔板，每组设5个复孔。细胞感染8h后，加入CCK8溶液，放入CO2培养箱中继续培养2h，在酶标仪450nm波长处测出各组吸光度值，检测细胞活力，选取8h内细胞死亡过半组的MOI（MOI=20∶1）作为下一步最适实验浓度。复设实验对照组和MOI=20∶1染菌细胞实验组。细胞接种于6孔板，每组3个复孔，细胞培养8h后收集各组细胞提取总RNA。用RT-PCR方法检测。查询目的基因设计引物，设PCR反应条件为：95℃预变性10min1个循环，95℃变性30s、44℃退火30s、72℃延伸1min共34个循环，72℃再延伸10min。将PCR扩增产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳。将各测量组电泳照片扫描至计算机，测定电泳带各条带的积分光密度值。 结果：1、CCK8检测结果显示：8小时内，随着菌种浓度的增大，细胞活力逐渐减弱，感染复数（MOI）为20∶1菌种浓度处理的HaCaT细胞8h细胞死亡过半，选择作为下一步最适实验浓度。2、根据电泳带各条带的积分光密度值结果显示：与空白对照组相比，染菌后的HaCaT细胞中TLR2mRNA增高了约64%，hBD-3mRNA增高了约160%，二者的表达量成正相关，hBD-3的表达比TLR2的表达增高了约96%（P＜0.05）。 结论：1、金葡菌感染可以造成人角质形成细胞活力减弱。2、感染金葡菌的角质形成细胞内TLR2mRNA和hBD-3mRNA的表达增高，TLR2的增高能进一步刺激hBD-3的更高表达。 综述：简要分析了金葡菌、角质形成细胞、Toll受体、TLR2、β-防御素、hBD-3的功能和关系，初步探讨被金葡菌侵染的角质形成细胞内TLR2及hBD-3的免疫机制。

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学术硕士学位论文

Keywords:Staphylococcus aureus;HaCaT cells;TLR2;hB

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材料与方法

1.主要材料及试剂

1.1主要仪器

1.2主要试剂

引物设计 Primer Premier

1.3常用溶液配置

2.方法

2.1 HaCaT细胞培养

⑴从超低温冰箱中取出冻存管，37℃水浴晃动直至融化，移至15ml离心管，另加入3～5倍完全培

2.2 金黄色葡萄球菌培养

2.3 最适菌种浓度筛选

CCK-8实验原理：试剂中含有WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)

2.4金葡菌对角质形成细胞中TLR2和hBD-3 mRNA表达的影响

2.4.1实验分组与处理

2.4.2.1总RNA的提取

提取原理：试剂盒使用特有的裂解液，迅速裂解细胞并灭活其中的RNA酶，然后加入适量乙醇对结合条件进行调

2.4.2.2 RNA纯度及浓度检测

2.4.2.3 RT-PCR检测

实验原理：实验以mRNA逆转录产生的第一条cDNA链作为模板，进行DNA片段的扩增，即逆转录聚合酶链

在的条件下进行酶促反应。反应分为三步：1.变性：加热——使DNA双链间的氢键断裂，形成DNA单链；2

2.4.2.4琼脂糖凝胶电泳

实验原理：琼脂糖作为天然的聚合长链分子，根据浓度的不同，其形成的刚性滤孔孔径的大小也不相同。DNA分

通过测算各电泳图片的积分光密度显示：金葡菌感染的HaCaT细胞中TLR2和hBD-3 mRNA的表达

表4 电泳图片的积分光密度（INT*mm2）

综 述

染菌角质形成细胞中TLR2及hBD-3的免疫机制

综述参考文献

攻读学位期间的研究成果

致 谢