EGCG通过Nrf2/ARE信号通路对鱼藤酮所致帕金森病样损伤模型的作用及机制研究

摘要

目的: 表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是绿茶儿茶酚的主要成分，流行病学调查表明绿茶是预防帕金森病的保护性因素。帕金森病患者黑质致密部氧化损伤的生物学标志物显著升高，氧化应激是帕金森病可能的病因之一。核转录因子红细胞系-2p45相关因子2/抗氧化反应元件信号通路（Nrf2/ARE pathway）调节Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、抗炎蛋白等物质转录，是调控氧化还原水平的核心通路。研究证明EGCG参与Nrf2/ARE调控。本研究旨在探究EGCG是否对帕金森病神经损伤具有保护作用，并从Nrf2/ARE信号通路入手探讨可能的作用机制。 方法: 1.利用鱼藤酮孵育SH-SY5Y细胞制备帕金森病模型，不同浓度（10mmol/L，20mmol/L，40mmol/L）EGCG孵育24h，用CCK-8法和LDH释放实验检测细胞存活率，Western蛋白免疫印迹法检测功能相关蛋白酪氨酸羟化酶TH及凋亡相关蛋白Bax，按照试剂盒方法检测抗氧化相关指标（MDA，SOD，ROS，GRx）。 2.以siRNA干扰Nrf2基因表达，并采用RT-PCR检测干扰效果；检测合格后，用siNrf2干扰后的细胞制备帕金森病模型并以EGCG孵育24h，进行细胞存活率和细胞ROS含量测定。 3.利用鱼藤酮制备小鼠帕金森病模型，随机分组为阳性对照组（司来吉兰）、EGCG高（80mg/kg）、中（60mg/kg）、低（40mg/kg）组，连续灌胃给药21天，测定各组实验动物运动水平，进行爬杆实验和运动能力检测。 结果： 1.与细胞帕金森病模型组相比，各浓度EGCG处理组均显著增加细胞存活率（p＜0.01），显著降低细胞LDH溢漏率（p＜0.01），20mmol/L EGCG能显著降低细胞Caspsse-3相对活性和Bax蛋白表达水平（p＜0.05），10mmol/L和40mmol/LEGCG组对Caspsse-3和Bax水平无显著影响（p＞0.05）。10mmol/L和20mmol/LEGCG组上调神经细胞功能蛋白TH的表达水平（p＜0.05），40mmol/LEGCG无显著影响（p＞0.05）。该结果表明，适宜浓度EGCG能够减轻鱼藤酮造成的神经细胞损伤，减少细胞凋亡并维持细胞功能。 2.与细胞帕金森病模型组相比，各浓度EGCG组的总GPx活性显著增强（p＜0.01），MDA含量、ROS含量均显著降低（p＜0.05），20mmol/L和40mmol/LEGCG组总SOD单位数显著增加（p＜0.05），说明EGCG处理能够参与抗氧化酶的调控，减少鱼藤酮所致的氧化损伤。 3.与对照组相比，EGCG能够上调Nrf2蛋白表达水平（p＜0.05），说明EGCG对Nrf2具有激活作用，且20mmol/L时激活作用最为显著。将siNrf2干扰细胞制备帕金森病模型，与鱼藤酮模型组相比，EGCG处理组的细胞存活率和ROS含量均差异不显著（p＞0.05）。 4.与对照组相比，模型组小鼠运动能力显著下降（p＜0.05）；与鱼藤酮模型组相比，阳性药组、高剂量组、中剂量组运动水平显著提高（p＜0.05），低剂量组无显著差异（p＞0.05）。 结论： EGCG能够对鱼藤酮所致的神经细胞活性损伤和氧化损伤发挥保护作用，并增强帕金森模型小鼠的运动能力。Nrf2/ARE信号通路是EGCG发挥保护作用的重要通路之一。

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EGCG通过Nrf2/ARE信号通路对鱼藤酮所致帕金森病样损伤模型的作用及机制研究

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Abstract

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实验材料

1细胞株

2实验动物

3试剂

4仪器设备

5主要试剂配制

实验方法

1细胞培养

1.1细胞复苏

1.2细胞传代

1.3细胞冻存

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3.2反转录

3.3RT-PCR检测

4CCK-8法细胞存活率检测

5乳酸脱氢酶（LDH）释放率检测

6Caspase 3活性检测

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7总谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性检测

8总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测

9丙二醛（MDA）活性检测

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11.2BCA法检测蛋白含量

11.3SDS-PAGE凝胶的制备

11.4电泳样品的制备、上样及电泳

11.5湿法转膜

11.6免疫反应

11.7显影及灰度分析

11.8抗体信息

12小鼠造模及给药

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13小鼠行为能力检测

13.1爬杆实验

13.2行进步数实验

将小鼠放置于粗糙桌面，记录30s内左前肢行进步数。

14统计学分析

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1.2CCK-8法检测细胞存活率

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1.3LDH释放率

不同浓度EGCG、50 μmol/L SE与1 μmol/L鱼藤酮共孵育24 h对SH-SY5Y细胞

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2.1细胞总GPx活性

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2.4细胞ROS含量

3Nrf2/ARE信号通路对EGCG神经保护作用的影响

3.1EGCG对SH-SY5Y细胞Nrf2蛋白表达水平的影响

不同浓度EGCG孵育24 h对SH-SY5Y细胞Nrf2蛋白表达量的影响如图11所示。与对照组相比，

3.2siRNA干扰结果检测

以管家基因ACTB mRNA的表达量作为参照标准，检测细胞Nrf2 mRNA的相对表达量，两者的熔解

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3.3siRNA干扰后细胞存活率

3.4siRNA干扰后细胞ROS含量

4EGCG对帕金森病小鼠模型运动能力的影响

4.1EGCG对小鼠纹状体Nrf2蛋白表达水平的影响

4.2爬杆实验

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4.3小鼠行进步数实验

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2.1 Nrf2/ARE信号通路的分子基础

2.2 Nrf2/ARE通路的生理作用

2.3 Nrf2/ARE通路调控机制

2.3.1 蛋白质水平调控

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2.3.2 表观遗传学调控

2.3.3 小分子化合物

2.3.4 通路负反馈调节

3.1 泌尿系统疾病

3.5 神经系统疾病

3.6 生殖系统疾病

3.7 其他

致谢