大豆高效转基因技术体系的建立及Na/H逆向转运蛋白(TaNHX2)基因的导入研究

摘要

大豆是重要的粮食、油料和饲料作物，也是人类蛋白质食物、工业原料的主要来源之一，大豆在医药保健以及防病治病方面，也有一定的用途。全世界抗除草剂转基因大豆的迅速发展，展示了转基因育种在大豆品种改良中的广阔发展前景。与此形成鲜明对比，我国大豆转基因育种进展缓慢，主要原因是遗传转化操作转化效率低、转化植株再生频率低以及重演性差等。因此，建立理想的、高效的大豆转化体系是目前研究热点之一。
　　 本研究利用大豆子叶节为外植体，用含植物双元表达载体pBIN438-35S-TaNHX2的农杆菌AGL1对大豆进行转化，探索外植体大小、培养基主要成分、培养时间等因素对外植体分化的影响，旨在优化遗传转化条件，提高大豆转基因的遗传转化效率，培育抗逆相关的小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因(TaNHX2)的转基因大豆新种质。
　　 主要结果如下：
　　 1、鉴定出再生率高的大豆基因型。15个不同基因型大豆子叶节，用农杆菌菌株(含pBIN438质粒)AGL1浸染时，不同基因型的丛生芽获得率和再生率差异显著，变化范围分别为22～73％和4～58％，从中筛选出适合大豆遗传转化的基因型，包括中豆32、吉林小粒1号、绥农14和早熟18等品种。研究发现，转化率和再生率高的大豆基因型，对农杆菌也比较敏感。
　　 2、研究了pH值和6-BA对遗传转化的作用。利用早熟18研究了大豆转化条件，研究表明，在诱导丛生芽阶段，既有利于激素进入植物细胞，又适于大豆自生生长发育的最适pH值为5.7。在培养中豆32时，在萌发和不定芽2种培养基中都加入6-BA，丛生芽率比不加和只在单个培养基加6-BA提高0.7倍以上。
　　 3、建立了最佳的遗传转化方法。通过对萌发培养基6-BA浓度(A)、诱导丛生芽培育基6-BA浓度(B)、浸染时间(C)、共培养时间(D)这四个因素的正交试验分析，结果表明，四个因素对抗性芽伸长诱导的效果存在较大差异。最佳的遗传转化方法为大豆萌发和不定芽诱导时分别加入0.5 mg L-16-BA和1.0 mg L-16-BA，浸染时间为30min、共培养时间为3d；外植体大小为2/3子叶，kan抗性筛选浓度第一阶段和第二阶段分别是60和50 mg L-1。
　　 4、培育出转基因大豆新材料。利用筛选出的最佳遗传转化方法，对中豆32子叶节进行抗逆相关的小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因(TaNHX2)遗传转化，获得转基因再生植株，经PCR分子检测，证明目的基因TaNHX2已导入并整合到大豆基因组中，转化率为3.78％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1、大豆遗传转化研究进展

1.1大豆遗传转化的再生体系

1.2大豆转基因方法研究进展

1.3大豆遗传转化应用研究现状

1.4农杆菌介导的大豆遗传转化的主要障碍及可能的解决途径

2、Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系

3、本研究的目的

3.1研究的意义

第二章 材料与方法

1、实验材料

1.1大豆材料

1.2农杆菌菌株及质粒载体

1.3仪器

1.4主要试剂和耗材

2、方法

2.1培养基成分

2.2质粒的PCR检测及菌株保存

2.3大豆的转化和再生

2.4激素对芽伸长影响的正交试验设计

2.5再生频率计算方法

2.6转基因植株PCR检测

第三章 结果与分析

1、质粒的PCR鉴定

2、不同基因型大豆再生频率的比较

2.1 AGL1(pBIN438-TaNHX2)菌株浸染不同基因型大豆的转化频率与再生率结果与分析

3、不同大豆基因型对农杆菌的易感性比较

3.1大豆敏感性基因型的筛选

3.2大豆转化条件的探索

3.3 pH值对诱导丛生芽的影响

3.4 6-BA对中豆32丛生芽率的影响

3.5不同基因型再生率能力比较

3.6四种不同因素对中豆32丛生芽率和芽伸长率的影响

4、大豆的转化及再生

5、再生植株检测

5.1 PCR检测

第四章 讨论与结论

1、讨论

1.1标记基因的消除

1.2基因型对农杆菌遗传转化的影响

1.3激素浓度、共培养时间、浸染时间和筛选压力对转化效率的影响

1.4进一步解决的问题

2、结论

参考文献

致 谢

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附录