cGAS信号通路介导牛分枝杆菌激活小鼠髓源树突状细胞免疫应答的研究

摘要

牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）是一种导致牛结核病的典型胞内病原菌，可跨物种传播给人和其他哺乳动物。在全球造成了重大的经济损失，并威及社会公共卫生安全。近期，美籍华人科学家陈志坚教授课题组发现了一种新型的DNA识别分子，环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)，cGAS属于核苷酸转移酶成员，可特异性识别细胞质中的双链DNA，催化合成cGAMP，进而依赖STING介导的信号通路诱导Ⅰ型干扰素的产生。长期以来的研究都将巨噬细胞作为结核菌感染的主要宿主细胞，但随着树突状细胞生理功能的逐步明了，其在结核菌感染中的作用越来越受到人们的重视。本实验旨在探究小鼠髓源树突状细胞（murine bone marrow derived dendritic cell，BMDC）感染牛分枝杆菌后，cGAS信号通路的表达，以及对BMDC成熟及活化的调控，进一步探究感染后CD4+T细胞的免疫应答，阐明相关作用机制。
　　1.利用体外诱导的方法，原代分离BMDC，且纯度达到90％以上。通过Western blot检测感染后BMDC中cGAS及其下游相关蛋白的表达情况，利用免疫荧光显微镜观察IRF3的入核现象。结果显示，感染后cGAS、p-TBK1的蛋白表达量上升，STING表现出双条带，IRF3入核现象明显。而利用siRNA沉默cGAS后，下游相关蛋白表达均受到抑制，IRF3入核现象减弱。
　　2.利用流式细胞术以及Ⅰ型干扰素受体阻断剂，检测感染后BMDC表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表达情况，利用ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情况。结果显示，感染后表面标志物表达量显著上升，而cGAS沉默后以及Ⅰ型干扰素受体阻断后，表达量均受到抑制。细胞因子的变化趋势基本与之相同，但TNF-α不受阻断剂的影响。添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上调，而IL-10、IL-6则无明显变化。
　　3.利用免疫磁珠方法从小鼠的脾脏特异性分离出CD4+T细胞，添加示踪性荧光标签后，建立BMDC与CD4+T细胞共培养体系，通过流式细胞术和ELISA技术分别检测CD4+T细胞的增殖情况以及IFN-γ的分泌。结果显示，感染组可显著诱导CD4+T细胞的增殖，而阻断Ⅰ型干扰素受体后扩增能力下降。感染后IFN-γ表达量显著上调，而在阻断组中则受到明显抑制。
　　综上所述，本研究表明，cGAS信号通路存在于BMDC中，感染牛分枝杆菌后cGAS及下游相关蛋白可被激活，并且cGAS信号通路以及Ⅰ型干扰素途径有助于BMDC表型的成熟和功能的活化，对抗原呈递起到促进作用。此外牛分枝杆菌感染BMDC后，可显著增强CD4+T细胞的扩增能力，提高IFN-γ的分泌量，诱发获得性免疫应答。

目录

论文说明

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摘要

第一章 引言

1．1 牛结核病的病原学研究

1．2 体内主要先天免疫细胞与结核分枝杆菌的相互作用

1．3 结核分枝杆菌的免疫逃逸机制

1．4 cGAS信号通路

1．5 本课题的研究意义

第二章 牛分枝杆菌的复苏、小鼠髓源树突状细胞的原代分离培养及纯度鉴定

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 分析与讨论

2．5 小结

第三章 牛分枝杆菌感染BMDC后cGAS信号通路表达研究

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 分析与讨论

3．5 小结

第四章 牛分枝杆菌感染BMDC后成熟及活化机制的研究

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 分析与讨论

4．5 小结

第五章 牛分枝杆菌感染BMDC后诱导CD4+T细胞的免疫应答

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

5．4 分析与讨论

5．5 小结

第六章 结论

参考文献

致谢

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