黑果枸杞和马蔺花青素生物合成关键基因的克隆和功能解析

摘要

植物花青素是类黄酮物质在生物合成中所产生的重要次生代谢产物，广泛存在于植物体内液泡中，是花卉、水果和蔬菜中的主要呈色物质。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）果皮和马蔺(Iris lactea Pall.var chinensis(Fisch.)Koidz，以下简称（I.lactea vat chinensis）花瓣中都富含大量的花青素，而这两种植物的花青素生物合成代谢机制目前尚未见报道。
　　本文以黑果枸杞和马蔺为材料，提取黑果枸杞果皮和马蔺花瓣的RNA进行转录组测序，从中筛选出黑果枸杞和马蔺花青素生物合成途经的关键基因并对其进行分离克隆和生物信息学特征分析;同时通过构建原核细胞表达载体及体外酶活性测定分析马蔺二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)基因的底物结合特性，并与荷兰鸢尾、矮牵牛、烟草等植物的DFR基因的底物结合特性进行比较，明确马蔺DFR基因编码的蛋白（酶）的底物偏好特性。本研究的研究结果如下:
　　1.根据转录组测序分析结果，筛选得到了黑果枸杞花青素生物合成途径中的7类关键基因，即查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、黄烷酮3-羟化酶（flavanone3-hydroxylase，F3H）、类黄酮3’-羟化酶(flavonoid3’-hydroxylase，F3'H)、类黄酮3'5’-羟化酶（flavonoid3’，5’-hydroxylase，F3'5'H）、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)和花青素合酶（anthocyanidin4-synthase，ANS）等基因(分别命名为rCHS、LrCHI、LrF3H、rF3'H、LrF3'5'H、LrDFR和LrANS)以及马蔺花青素生物合成途径中的1个关键基因，即二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)（命名为llDFR）的序列。将其登录到NCBI基因数据库上，并对这些基因进行了生物信息学特征分析和克隆验证。
　　2.将马蔺IlDFR、荷兰鸢尾IhDFR、矮牵牛PhDFR和烟草NtDFR基因构建原核表达载体pTrc-CKS（多克隆酶切位点MCS下游含6×His-Taq标签），并在大肠杆菌JM109中分别成功表达了4种蛋白，利用镍琼脂糖凝胶填充柱亲和层析法纯化得到这4种目的蛋白。
　　3.四种目的蛋白在NADPH的辅助作用下分别与二氢槲皮黄酮(dihydroquercetin，DHQ)、二氢山奈黄酮醇(dihydrokaempferol，DHK)和二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin，DHM）三种底物在体外进行酶促反应，通过HPLC检测发现，马蔺IlDFR蛋白可以有效的催化DHK、DHM两种底物，而基本不催化底物DHQ，并且对DHM的催化效率高于DHK;荷兰鸢尾IhDFR蛋白可以有效地催化DHQ、DHK和DHM三种底物，对DHK、DHM的催化效率高于DHQ;矮牵牛PhDFR蛋白和烟草NtDFR蛋白可以有效的催化DHQ、DHK和DHM三种底物，并且其催化效率相差不大。马蔺IlDFR和荷兰鸢尾IhDFR的底物特异性结构域均为“TVKRVVFTS SAGTVDVKEHQQMEYDESS WSDVEFCRRV”，而矮牵牛PhDFR、烟草NtDFR的底物特异性结构域分别为“TVKRLVFTSSAGTLDVQEQQKLFYDQTSWSDLDFIYAK”和“TVKRLVFTSSAGTLDA QEHQKLFYDETSWSDLDFIYAK”。第3个氨基酸残基均为赖氨酸(K)，带负电荷，理论上这4种蛋白主要催化DHQ和DHM，而催化DHK的效率较低，但这4种蛋白对底物的偏好和催化效率都不尽相同，再次证明了该结构域的其他氨基酸残基也影响着DFR对底物的选择。
　　该研究为今后利用分子生物学与基因工程技术定向培育花卉、水果和蔬菜的颜色提供新的基因资源和奠定技术基础。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1研究背景

1．2花青素生物合成

1．3蓝紫色花、叶、果实的形成

1．4黑果枸杞与马蔺

1．5研究目的及意义

第二章黑果枸杞和马蔺花青素生物合成关键基因的克隆与其生物信息学分析

2．1材料与方法

2．2结果与分析

2．3讨论与小结

第三章马蔺花青素生物合成关键基因二氢黄酮醇4-还原酶基因的底物结合特性解析

3．1材料与方法

3．2结果与分析

3．3讨论与小结

第四章结论

参考文献

附录

致谢

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