脂质体电动色谱及其用于评价药物膜转运

摘要

目前，新药的开发有将近一半的资金消耗在临床研究阶段，所以人们希望在临床研究前就发现具有类药特性的候选受试药物。同时，研究也表明，药物膜通透性对于其有效性和安全性起着关键作用，并认为新化合物的膜通透性筛选应该在其活性筛选之前或者两者同时进行。而脂质体电动色谱(liposome eleetrokineticchromatography，LEKC)就是评价药物膜通透性的工具之一。借助毛细管电泳高效快速的特点，把脂质体溶液加入到毛细管中作为运行溶液，脂质体作为一个假固定相，药物的迁移行为反映了其与脂质体的相互作用，称之为LEKC。本文旨在对LEKC进行基础研究之后，探寻药物在LEKC上的保留与其体内药理/药动学活性参数的关系，应用统计学方法建立定量保留-活性关系(quantitative retention-activityrelationships，QRARs)模型，以此作为药物膜通透性及活性的高通量筛选工具，为新药开发和中药活性成分筛选提供一个新的技术平台。 以精制的蛋黄磷脂(PC)、豆磷脂酰丝氨酸(PS)制备了三批脂质体，经过LEKC运行的考察，色谱系统重现性良好(RSD<8％)；72小时内LEKC的系统稳定性良好(RSD=4.12％)；脂质体中PS比例的增加导致酸性药物的LEKC保留减弱，碱性药物的LEKC保留加大；胆固醇和HPC通过影响脂质体的刚性而减弱溶质与脂质体的相互作用；缓冲盐的种类、浓度和离子强度都会影响到荷电药物的LEKC保留，通过对比研究发现，三者都是由于离子强度不同所造成，因为缓冲盐的反离子对脂质体的表面电荷和药物电荷起到了一定的屏蔽作用，降低了它们之间的静电作用力；运行溶液的pH值会影响药物的解离，从而影响到它们与脂质体之间的静电作用力。 采用线性溶剂化自由能关系(linear salvation energy relationship，LSER)方程研究药物在LEKC的分配机制，结果表明内聚能/分子体积和氢键碱度是影响分配的主要因素；脂质体中胆固醇的添加对脂质体的氢键度影响最大，使其迅速下降，同时也使得脂质体与HBD溶质之间的氢键作用显著降低。 LEKC、磷脂膜色谱(IAM)、正辛醇/水系统三者的亲脂性测量尺度明显不同，正辛醇/水系统体现的是疏水作用力，而LEKC又体现出了IAM所没有体现的静电作用力；收集了18个不同的亲脂性测量模型，对其进行亲脂性相似度的比较，矢量法的研究结果表明，LEKC与SOS：CTAB及SDS：DTAB-VEKC最为相似，而当所测试的分子都为中性化合物时，LEKC与正辛醇/水系统的相似亲脂性提示我们可以采用LEKC间接测定中性化合物的logP；与定量结构-活性关系模型的对比研究中发现，LEKC与透皮活性关系模型较接近；主成分分析(PCA)的研究结果更为直观，且与矢量法的研究结果基本一致，二者可以互为补充。用27个中性化合物(logP范围从0.5到4.5)建立了溶质保留因子(logk)与logP的关系，并以此对另外13种化合物的logP进行预测，预测结果良好；对25种药物的logk与其小肠吸收百分比(Abs％)进行相关研究，经细胞被动扩散的药物，其logk与Abs％呈较好的S形曲线关系。LEKC若与Caco-2技术相结合，将能够同时提供药物在吸收程度及转运方面的信息；以PCA方法研究了logk<,LEKC>、logk<,VEKC>、PSA、logP、logD<,7.4>五种亲脂性参数与药物透血脑屏障活性参数logBB的相似性，结果表明logk<,LEKC>与logBB最为接近，二者有显著的线性相关性，R<'2>=0.811；测定了22种化合物pH5.5条件下的LEKC保留因子，采用逐步回归的方法，引入其它理化参数，建立了药物透皮参数logKp与logk、MW/100、OHsNHs之间的预测模型，采用leave-one-out方法对模型进行了验证，与文献报道的其它预测模型相比较，本研究所测试的化合物性质、结构更多样，模型更具代表性，同时，LEKC技术也更具高通量筛选优势。

目录

缩略语表

声明

前言

第一章 脂质体电动色谱的影响因素考察

1 实验条件

1.1 试药、试剂及仪器

1.2 电泳条件

1.3 脂质体的制备

2 结果与讨论

2.1 LEKC实验的基本要求

2.2 电压的影响

2.3 脂质体组成的影响

2.4 脂质体浓度的影响

2.5 缓冲盐的影响

2.6 有机调节剂的影响

2.7 pH值的影响

3 本章小结

参考文献

第二章 脂质体电动色谱溶质分配机制研究

1 实验条件

1.1 试药、试剂及仪器

1.2 电泳条件

1.3脂质体的制备

2 结果与讨论

2.1 功能团选择性

2.2 LEKC保留因子的线性溶剂化方程

2.3 胆固醇对磷脂双层膜溶剂化性质的影响

2.4 胆固醇对各分子间作用力对溶质分配的影响

3 本章小结

参考文献

第三章 脂质体电动色谱与其它理化模型的比较研究

1 实验条件

1.1 试药、试剂及仪器

1.2 电泳条件

1.3 脂质体、囊泡的制备

2 结果与讨论

2.1 LEKC与IAM、正辛醇/水系统亲脂性测量尺度的比较

2.2 矢量法

2.3 PCA法

3 本章小结

参考文献

第四章 脂质体电动色谱用于评价药物膜转运

1 实验条件

1.1 试药、试剂及仪器

1.2 电泳条件

1.3 脂质体、囊泡的制备

2 结果与讨论

2.1 LEKC用于预测中性化合物的logP

2.2 麻药LEKC保留因子与其药理活性的关系

2.3 药物LEKC保留因子与小肠吸收百分比的关系

2.4 LEKC用于预测药物透血脑屏障

2.5 LEKC用于预测药物的透皮吸收

3 本章小结

参考文献

全文结论

致谢

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