16S rRNA基因和cpcHID操纵子序列对5个节旋藻样品亲缘关系的研究

摘要

节旋藻属于蓝藻门(Cyanopyta)、颤藻科(Oscillatoriaceae)、节旋藻属(Arthrospira)，是一类光合自养的原核生物。节旋藻是一类丝状不形成异型胞的蓝藻，常分布于湖泊、池塘和半咸水中，除可用作食品、饲料、饵料外，在医疗保健、精细化工和化妆品等领域均有着广阔的应用前景。大规模商业开发中所谓的“螺旋藻”实际上几乎都是节旋藻，但在商业上仍习惯称其为“螺旋藻”。当今国内外研究和商业化开发使用最多的2个种是钝顶节旋藻和极大节旋藻，它们的原产地分别为非洲Chad湖和墨西哥Texcoco湖。 1996年，乔辰教授等在鄂尔多斯高原碱湖发现了3种节旋藻和1种螺旋藻，填补了我国节旋藻和螺旋藻种质资源的空白。近些年对鄂尔多斯高原碱湖节旋藻的研究已有很多报道，主要集中在对该地区节旋藻的发现、形态解剖结构及生理生化特性等方面，未见基因序列测定方面的研究，特别是16S rRNA基因和cpcHID操纵子序列用于节旋藻亲缘关系的研究未见报道。 本文以内蒙古鄂尔多斯高原碱湖的钝顶节旋藻(A1)、鄂尔多斯节旋藻(A2)、方胞节旋藻(A3)、非洲Chad湖的钝顶节旋藻(A4)和墨西哥Texcoco湖的极大节旋藻(A5)为材料，采用溶菌酶法制备了5个节旋藻样品的基因组DNA，选用特异性引物克隆16S rRNA基因和cpcHID操纵子，并测定了它们的碱基序列。运用BioEdit、MEGA4.1和DNAStar分析软件对序列长度、碱基比例和序列问的同源性进行分析，构建系统发生树，并与GenBank中的相关序列进行比对，试图从基因水平探讨它们的进化地位及亲缘关系，丰富和完善节旋藻种质资源的基础研究，这对于鄂尔多斯高原碱湖节旋藻种质资源的保护和开发利用具有重要意义。 结果表明，5个节旋藻样品16S rRNA基因序列的长度在1334bp～1335bp之间；cpcHID操纵子的序列长度在1420～1424bp之间。16SrRNA基因序列的相似性高，达到84.4％～99.8％；cpcHID操纵子的序列相似性在42.1％～98.7％之间。cpcHID操纵子序列的GC含量比16S rRNA序列的少、碱基变异率比16S rRNA序列的大。2个基因序列聚类结果均表明，鄂尔多斯高原碱湖钝项节旋藻A1与方胞节旋藻A3最先聚为一类，亲缘关系最近；2个不同原产地的钝顶节旋藻A1和A4亲缘关系并不是最近的，这种差异主要是由于长期生存于不同地理环境下的相同物种接受着不同的进化压力，在基因水平上发生了较大变异。在进化的长河中，环境恶劣、变化大的鄂尔多斯高原碱湖的钝顶节旋藻A1为了生存基因组DNA的变异必然要比环境相对稳定的Chad湖钝项节旋藻A4的大。 在16S rRNA基因序列分析中，A2与A5的亲缘关系是最远的，而cpcHID操纵子的序列分析却表明二者亲缘关系是最近的。结合杨茜对其中4个节旋藻同工酶和可溶性蛋白分析聚类的结果，有关A2和A5的亲缘关系，笔者认为16S rRNA基因序列分析的结果可能更符合实际情况。有关A2在5个节旋藻样品中的分类地位和亲缘关系还须进一步深入研究证实。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 材料

1.1.2仪器

1.1.3 药品和试剂

1.2 实验方法

1.2.1 藻的培养

1.2.2基因组DNA的提取和纯化

1.2.3 PCR扩增

1.2.4基因克隆

2结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

2.1.1 DNA粗提液的检测

2.1.2 DNA提纯液的检测

2.2 16S rRNA基因克隆

2.2.1 16S rRNA基因PCR扩增

2.2.2 PCR产物凝胶回收

2.2.3克隆产物的蓝白菌落检测

2.2.4转化结果的PCR检测

2.2.5 16S rRNA基因的序列测定

2.3 cpcHID操纵子克隆

2.3.1 cpcHID操纵子PCR扩增

2.3.2 PCR产物凝胶回收

2.3.3克隆产物的蓝白菌落检测

2.3.4转化结果的PCR检测

2.3.5 cpcHID基因的序列测定

3 讨论

3.1 5个节旋藻样品的差异位点

3.2 5个节旋藻样品的亲缘关系

3.3与GenBank中相关序列的比较

4结论

参考文献

附录

致谢