应激与“上火”——广东凉茶作用机理与物质基础研究

摘要

本论文阐述了“上火”是机体对应激负荷在心理和生理过程中产生的一种不协调的应激反应，是一种超越生理调节范围内身心疲劳的表现。从“上火”到形成疾病是一种涉及中枢神经、内分泌及免疫系统的应激反应过程。本文主要研究内容为以应激负荷模拟大鼠和小鼠的“上火”状态，从动物整体水平及分子生物学水平研究“上火”的科学内涵；并通过研究岭南泻火名方广东凉茶的抗应激药理活性及其作用机制，力图阐明广东凉茶“清热泻火”作用机理；同时，建立广东凉茶的HPLC指纹图谱，并采用开放柱层析，中低压液相色谱(MPLC)以及高效液相色谱(HPLC)等适当的分离手段获得活性单体，确定相应的作用物质基础，提高广东凉茶质量标准。 首先，本研究以应激负荷模拟了大鼠和小鼠“上火”状态，论证了“上火”与应激导致的机体中枢神经递质变化、免疫功能下降、器官功能衰竭及糖脂代谢紊乱相关。并在此基础上，系统研究广东凉茶抗应激药理活性，实验从广东凉茶对自发转笼运动应激负荷大鼠行为及中枢神经递质的影响，对拘束应激负荷诱发小鼠免疫机能低下的影响，对应激状态下肝损伤及应激性炎症的影响，对应激性糖代谢紊乱的改善作用，以及对应激性脂代谢紊乱的改善作用等几个方面，评价了广东凉茶通过改善机体应激状态与防治疾病之间的关系，旨在阐明广东凉茶药理活性。实验结果显示，广东凉茶对转笼应激负荷大鼠脑内神经递质5-HT和5-HIAA水平下降有一定的改善作用，能显著降低转笼应激负荷大鼠大脑皮质丙二醛(MDA)水平，并显著提高大脑皮质的抗氧化能力指数(ORAC)。广东凉茶能减轻拘束应激负荷引起的免疫器官指数下降、缓解脾脏细胞总数减少、改善T淋巴细胞亚群比例紊乱、增加NK细胞及CTL杀伤活性等免疫学指标。淋巴细胞内氧化状态初步研究结果提示广东凉茶对拘束应激负荷引起的免疫功能低下的改善作用可能与广东凉茶提高拘束应激负荷小鼠脾细胞的抗氧化能力，并降低脂质过氧化产物(MDA)的含量有关。广东凉茶对拘束负荷诱发小鼠氧化应激性炎症及肝损伤有明显的改善作用，其改善作用可能是通过清除体内自由基和防止脂质过氧化实现的。此外，我们也发现广东凉茶能提高拘束应激负荷小鼠口服葡萄糖的血糖消除速率，并降低应激负荷小鼠血浆酮体水平和促进其肝糖原的合成能力，加速糖能源的利用，提高机体的耐糖能力，调节应激性糖代谢紊乱。广东凉茶能提高拘束应激负荷小鼠的血浆甘油三酯(TG)消除速率，同时提高肠系膜脂肪酶(LPL)的活性，加速脂肪能源的利用，增加动物的脂肪耐受能力。以上实验结果表明，广东凉茶“泻火”的作用机理与广东凉茶对机体应激负荷状态的改善作用有关。 在广东凉茶能有效改善机体应激负荷状态的药理活性研究基础上，以广东凉茶能改善拘束负荷诱发小鼠免疫机能低下这一实验结果为例，本研究进一步探讨广东凉茶改善机体应激负荷状态的作用机制。实验首先通过检测拘束负荷小鼠脾脏淋巴细胞内的MDA和ORAC水平，确定细胞内氧化及抗氧化状态。然后，通过流式细胞术荧光染料特异性标记检测拘束负荷小鼠脾脏淋巴细胞内的含氮类自由基(RNS)及活性氧(ROS)的水平。同时，测定小鼠脾细胞内自由基清除系统的关键酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽转移酶(GPX)的活性。此外，我们还从基因水平检测自由基产生的关键酶一氧化氮合酶(iNOS)和自由基消除的关键酶SOD的mRNA表达水平的变化。本研究通过对上述细胞内的自由基产生和消除通路中各指标的测定，探讨应激负荷造成机体损伤的氧化应激机制，进而揭示广东凉茶能改善应激负荷状态的科学内涵。实验结果发现，拘束负荷小鼠脾脏淋巴细胞内ROS和RNS含量显著增加，表明拘束负荷对机体造成的应激损伤可能和体内毒害自由基的过渡产生有关。RT-PCR对一iNOSmRNA表达分析结果进一步证实，拘束负荷能明显提高细胞内iNOSmRNA的表达水平，表明应激负荷小鼠体内含氮类毒性自由基的大量产生可能是应激负荷激活体内相关基因的表达有关。拘束负荷组小鼠细胞内自由基消除链式反应中关键酶SOD和GPX的活性及相关基因的表达异常，同时小分子抗氧化物质GSH含量减少，结果表明应激负荷时自由基消除链式反应的关键酶活性紊乱及重要小分子抗氧化物质的耗竭进而引起细胞内的氧化应激损伤可能也是机体应激损伤的机制之一。广东凉茶通过调节拘束负荷小鼠体内RNS及ROS的产生，减少毒害作用较强的自由基·ONOO-及·OH的过度产生，同时调节清除自由基的链式反应中关键酶SOD和GPX的活性及相关基因的表达，保护小分子抗氧化物质GSH的耗竭。因此，广东凉茶有调节应激负荷状态下机体氧化平衡的作用，通过缓解氧化应激水平继而改善机体的应激状态。 在以上广东凉茶“泻火”作用机理和机制的研究基础上，本研究通过不同色谱条件摸索建立了广东凉茶的HPLC指纹图谱，以确定广东凉茶作用物质基础。并利用多种现代色谱分离手段(包括大孔树脂DiaionHP-20，ODS，SephadexLH-20柱色谱，HPLC等)，富集并分离得到了HPLC指纹图谱中的8个主要色谱峰，占总峰面积的93.63％。通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了它们的化学结构为Gallicacid，Protocatechuicacid，(+)-Catechin，4-Hydroxybenzoicacid，Caffeicacid，Ellagicacid-4-O-xylopyranoside，Isoquercitrin，Ellagicacid。通过体外活性测试，测定了所分离得到的8个主要色谱峰化合物对自由基的清除能力(用抗氧化能力指数ORAC值表示)以及对应激负荷小鼠脾脏淋巴细胞产生活性氧的自由基链式反应的调节作用(测定对ROS的抑制率)，结果发现多数化合物为活性成分，且活性与对照用药物维生素C相当或者更强。十批次凉茶产品HPLC分析研究结果显示广东凉茶HPLC指纹图谱的色谱行为稳定，不同批次产品间色谱图的相似度达到0.987以上，已经初步建立了一套与活性相关的多组分/指纹图谱控制产品质量的方法。 综上所述，“上火”是一种应激性反应，是机体受到应激原刺激引起的一种为维持内环境稳定的适应能力的超负荷状态。应激负荷能导致机体过氧化损伤，破环机体内环境稳定，进而导致动物的行为、神经、免疫、糖脂代谢等功能的改变，这可能是“上火”发生的主要原因。广东凉茶则通过调节应激负荷状态下机体的氧化平衡状态，通过缓解细胞内的氧化应激从而改善机体的应激状态，达到“泻火”的功效。本研究对广东凉茶通过调节体内平衡达到泻火作用有更深刻的认识，并发现其存在的内在规律，结果有望对中草药、凉茶及保健食品行业的发展起到示范推广作用，并有助于推进中医药现代化与国际化的进程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语说明、图表目录

声明

第一章 前言

第一节 应激反应与"上火"

一、机体应激反应与"上火"

二、应激反应与"上火"及内环境稳定

三、应激反应与"上火"及神经-内分泌-免疫系统

四、应激反应与"上火"及机体能量代谢

第二节 抗应激与"泻火"及广东凉茶

一、抗应激与"泻火"方式

二、凉茶文化

三、广东凉茶

第三节 应激动物模型

一、应激动物模型研究

二、拘束模型制作和影响因素

三、拘束应激对生理机能的影响

四、拘束应激的作用机制

五、拘束模型运用和前景展望

第二章 应激状态与"上火"及广东凉茶干预作用

第一节 应激反应与中枢神经递质变化及广东凉茶的干预作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第二节 应激反应与免疫功能低下及广东凉茶干预作用

2.1应激反应与非特异性免疫功能低下及广东凉茶干预作用

2.2应激反应与特异性免疫功能低下及广东凉茶干预作用

第三节 应激反应与肝脏炎症及广东凉茶干预作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第四节 应激反应与糖代谢紊乱及广东凉茶干预作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第五节 应激反应与脂代谢紊乱及广东凉茶干预作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第三章 应激损伤机制及广东凉茶干预作用机制探讨

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第四章 广东凉茶抗应激作用物质基础的初步研究

第一节 广东凉茶HPLC指纹图谱研究

一、广东凉茶指纹图谱的建立

二、指纹图谱中主要色谱峰的分离

三、指纹图谱中主要色谱峰的化合物结构鉴定

四、多批次广东凉茶样品的HPLC分析及相似度考察

第二节 广东凉茶抗应激活性部位的研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第三节 广东凉茶抗应激活性成分的初步研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第四节 广东凉茶主要组成药材化学成分及药理作用研究

一、广东凉茶主要单味药材HPLC分析

二、金樱根主要化学成分研究

三、金樱根对拘束负荷小鼠肝损伤的保护作用

四、金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎小鼠的保护作用

五、金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎小鼠的保护作用机制研究

第五章 讨论与总结

一、问题与讨论

二、结果与结论

三、创新与突破

四、前景与展望

参考文献

附录

致谢