微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯

摘要

泛酸，即维生素B5，广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶A的主要原料，其主要作用是参与糖、脂肪和蛋白质的代谢，广泛应用于医药、饲料和食品等领域。D-泛解酸内酯是D-泛酸合成过程中重要的手型中间体，生产D-泛酸的关键技术是DL-泛解酸内酯的手性拆分技术。对比采用昂贵手性拆分剂的化学拆分方法，微生物酶法拆分具有原料成本低，条件温和，易于操作，环境友好等优点。 通过比较各种生物法的拆分路线，本课题采用选择性水解D型内酯的路线，即用D-立体专一内酯水解酶水解消旋内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，再通过内酯化得到D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯经过消旋化可以反复使用。该路线不要求水解彻底，反应时间短，得到的产品D-泛解酸内酯光学纯度高，反应容易控制，而且底物的浓度可以达到很高的水平。 本文通过筛选得到一株具有较高D-泛解酸内酯水解酶活性的菌株Fusariumavenaceum3.4594，并以生物量和酶活为指标考察该菌的产酶发酵条件，确定其培养最佳条件是温度28℃，培养基初始pH5.0，培养72h。海藻酸钙包埋的方法固定化菌体，明显提高菌体酶的稳定性和重复利用率，且易于保藏。同时以相对酶活和固定化收率为指标评价了固定化条件，确定了最佳固定化条件，固定化细胞粒径2.5mm，CaCl2溶液的浓度30g·L-1，固定化时间为1h，海藻酸钠的浓度为24g·L-1，包埋率为200g·L-1。以固定化的细胞为催化剂，考察了催化的条件，其最佳催化条件为温度30℃，pH7.0左右，固定化细胞的加入量在30～40g/100ml底物溶液，底物浓度为100～200g·L-1，催化时间为14h之内，水解率30％左右，最终得到产物的ee值为90.1％ee以上。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1 D-泛酸及其衍生物

1.1.1泛酸

1.1.2 D-泛酸钙

1.1.3 D-泛醇

1.1.4 D-泛硫乙胺

1.2 D-泛解酸内酯

1.3 DL-泛解酸内酯的酶法拆分

1.3.1不对称还原酮基泛解酸内酯路线

1.3.2不对称氧化和还原两步酶法转化消旋泛解酸内酯

1.3.3选择性水解DL-泛解酸内酯

1.4立题背景及意义

第二章产泛解酸内酯水解酶菌种的筛选

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1菌种初筛

2.2.2菌种复筛

2.3结果与讨论

2.3.1菌种初筛

2.3.2菌种复筛

2.4小结

第三章Fusarium avenaceum 3.4594产酶条件的考察

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1泛解酸内酯和泛解酸的HPLC检测条件

3.2.2生物量与酶活的测定方法

3.2.3温度对产酶条件的影响

3.2.4初始pH对产酶条件的影响

3.2.5产酶时间曲线的绘制

3.3结果与讨论

3.3.1温度对产酶条件的影响

3.3.2初始pH对产酶条件的影响

3.3.3产酶时间曲线

3.4小结

第四章海藻酸钠固定化Fusarium avenaceum 3.4594的研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1相对酶活与固定化收率的测定

4.2.2海藻酸钠固定化Fusarium avenaceum 3.4594菌株

4.2.3粒径大小对固定化细胞的影响

4.2.4 CaC12浓度对固定化细胞的影响

4.2.5海藻酸钠浓度对固定化细胞的影响

4.2.6包埋率对固定化细胞的影响

4.2.7固定化时间对固定化细胞的影响

4.3结果与讨论

4.3.1固定化细胞的形态观察

4.3.2粒径大小对固定化细胞的影响

4.3.3 CaC12浓度对固定化细胞的影响

4.3.4海藻酸钠浓度对固定化细胞的影响

4.3.5包埋率对固定化细胞的影响

4.3.6固定化时间对固定化细胞的影响

4.4小结

第五章固定化细胞拆分DL-泛解酸内酯

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1薄层色谱条件

5.2.2 D-PL、L-PL旋光标准曲线的绘制

5.2.3 D-PA、L-PA旋光标准曲线的绘制

5.2.3 DL-PL自发水解的研究

5.2.3 pH对固定化细胞催化的影响

5.2.4温度对固定化细胞催化的影响

5.2.5底物浓度对固定化细胞催化的影响

5.2.6固定化细胞加入量对固定化细胞催化的影响

5.2.7固定化细胞拆分DL-PL时间曲线的绘制

5.2.8旋光法和高效液相法对固定化细胞的水解反应程度的监测的比较

5.2.9固定化细胞拆分DL-PL产物回收

5.2.10固定化细胞催化反应的稳定性

5.2.11固定化细胞的保藏方法的考察

5.3结果与讨论

5.3.1薄层色谱

5.3.2 D-PL、L-PL旋光标准曲线的绘制

5.3.3 D-PA、L-PA旋光标准曲线的绘制

5.3.3 DL-PL自发水解的研究

5.3.4 pH对固定化细胞催化的影响

5.3.5温度对固定化细胞催化的影响

5.3.6底物浓度对固定化细胞催化的影响

5.3.7固定化细胞加入量对固定化细胞催化的影响

5.3.8固定化细胞拆分DL-PL时间曲线的绘制

5.3.9旋光法和高效液相法对固定化菌体的水解反应程度的监测的比较

5.3.10固定化细胞拆分DL-PL的结果

5.3.11固定化细胞催化反应的稳定性

5.3.12固定化细胞的保藏方法的考察

5.4小结

结论

参考文献

致谢

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