更年期综合征及贯叶连翘治疗机制的代谢组学研究

摘要

[目的和意义]
　　更年期综合征是干扰中老年妇女生活质量的重要影响因素。虽然现代分子学已发现更年期综合征可能与内分泌、免疫、自由基及细胞凋亡有关，但这些独立的机制与病理表征之间的联系仍不明确。
　　贯叶连翘被认为是治疗更年期综合征长效、安全的中草药之一，临床用于替代雌激素疗法，以降低因长期服用雌激素而罹患乳腺癌、冠心病、中风和血栓的风险。在治疗更年期抑郁、潮热、肥胖、记忆衰退、风湿类风湿等疾病方面疗效尤其显著。然而贯叶连翘活性成分十分复杂，且给药剂量多样，使其临床治疗有效性受到质疑。目前大部分的临床研究主要集中在贯叶连翘的抗抑郁作用上，但这些研究成果并不适于对更年期综合征治疗机制的解释，说明贯叶连翘的治疗策略及对更年期综合征的干预机制还有待于进一步发掘。
　　为了了解更年期综合征的代谢特征，探索贯叶连翘在治疗过程中对已知或未知生物通路的作用。本研究利用一维核磁共振(1H-NMR)靶向代谢组学及液质联用技术(HPLC-MS/MS)的发现代谢组学研究方法，结合化学计量学方法，寻找浓度或丰度改变显著的模型差异表达代谢物，通过鉴定代谢物结构，构建更年期综合征体内代谢轮廓与疾病代谢表型关系的代谢网络，从生化、病理和代谢三个水平深入研究贯叶连翘对更年期综合征的代谢调控，期望从代谢物水平上揭示贯叶连翘对更年期综合征的调控机制。
　　[研究方法]
　　1.以大鼠去卵巢模型模拟更年期妇女卵巢激素缺乏导致更年期综合征的病理状态。采用1H-NMR及HPLC-MS/MS技术，对OVX及正常样本进行快速代谢物差异分析，靶向测定差异表达的代谢物，结合多元统计分析方法，选定疾病诊断生物标记物。
　　2.利用ChenomxNMR定量分析软件对生物样本中的小分子代谢物进行定量，建立1H-NMR靶向代谢组学研究方法。
　　3.，采用HPLC-MS/MS技术，以多个pH值液液萃取系统提取尿样代谢物，建立了非靶向的、基于质谱的发现代谢组学研究方法，以增加1H-NMR测定结果的可靠性。
　　4.对不同剂量贯叶连翘给予OVX大鼠后的代谢特征进行分类比较，鉴定并定量分析贯叶连翘对更年期综合征干预的差异表达代谢物。寻找给药靶器官，构建贯叶连翘治疗机制的代谢网络，选定治疗生物标记物，建立代谢组学药物治疗疗效评价模型。
　　[结果与讨论]
　　1.以偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和方差分析方法对1H-NMR和HPLC-MS/MS分别得到的代谢物进行筛选，结果得到53个与更年期综合征诊断相关的差异表达代谢物。将代谢物进行代谢网络构建后发现，有6条代谢通路与更年期综合征显著相关，包括糖酵解和糖异生、三羧酸循环、脂肪酸生物合成与氧化代谢、蛋氨酸循环、一碳单位途径和尿素循环（精氨酸及脯氨酸代谢）途径。
　　其中，柠檬酸、3-羟基丁酸和丙酮酸水平下降，棕榈酸、肉毒碱和乙酰基肉毒碱水平上升可作为更年期体重异常的诊断标记物;胆碱、甜菜碱和蛋氨酸水平上升，牛磺酸和N，N-二甲基甘氨酸(DMG)水平下降可作为更年期抑郁症的诊断标记物;γ-氨基丁酸水平下降，谷氨酸、组氨酸、甲基组氨酸和精氨酸水平上升可作为更年期记忆衰退的诊断标记物;鸟氨酸、胞嘧啶、β-丙氨酸和精胺水平上升可作为更年期乳腺癌的诊断标记物;血清尿囊素、谷氨酸水平上升，谷氨酰胺水平下降可作为更年期痛风的诊断标记物;5-羟色胺(5-HT)、色氨酸和甲酸水平下降，3-吲哚磺酸水平上升可作为更年期潮热及慢性肾病的诊断标记物。
　　2.对不同月龄大鼠尿样代谢物水平比较结果显示，有29个差异表达的代谢物与年龄增长有关，与对照组相比大部分代谢物呈现下降趋势。其中烟酰胺、N-甲基烟酰胺、胍基丁胺、亚精胺和精胺被选定为指示自然更年期疾病的生物标记物。这些代谢物水平的降低，可以用于预测肝脏线粒体功能随着机体衰老而逐渐减少，NAD+呼吸链反应效能降低，机体氧化应激反应加速产生，炎症反应增多，最终导致心血管疾病、糖尿病和认知性疾病等慢性疾病的产生。
　　3.通过比较不同剂量贯叶连翘给药前后OVX大鼠的代谢物水平结果显示，贯叶连翘能够逆转多个更年期综合征生物标记物的紊乱变化，并呈现出与相关酶活性及受体饱和度的相关的治疗作用。经筛查、鉴定和定量给药前后血清和尿样中的差异调节代谢物，有23个代谢物在解释贯叶连翘治疗机制方面具有重要意义。代谢网络构建结果显示，与贯叶连翘治疗机制相关的代谢物和中间体生化途径涉及4条主要代谢通路，包括精氨酸和脯氨酸代谢途径、丙酮酸代谢途径、组氨酸代谢途径和脂肪酸合成途径。
　　结合代谢物水平变化与代谢通路分析显示，贯叶连翘作用的主要靶器官是肝脏，其治疗作用是从调节肝脏代谢中精氨酸、鸟氨酸、蛋氨酸、牛磺酸、肉毒碱和三羧酸循环中间代谢产物的水平恢复开始的。其次使胆碱、甜菜碱生成正常，改善了脾脏的退行性变化，增强了脾脏的抗炎作用，进一步抑制了与炎症效应相关的更年期阿尔茨海默病、糖尿病和类风湿关节炎等疾病的产生。另外，贯叶连翘还能通过显著降低3-吲哚磺酸在肾脏的蓄积，降低肾小管上皮细胞中的NF-kappaB表达，产生解毒效应，使慢性肾脏疾病症状得到缓解。3-吲哚磺酸水平下降使得色氨酸水平恢复正常，促进色氨酸代谢生成5-HT，恢复5-HT对体温中枢的调节能力，产生缓解潮热症状的作用。
　　[结论]
　　1.本研究运用1H-NMR和HPLC-MS/MS技术，结合多元统计方法，对更年期雌激素衰亡诱发代谢紊乱的分子机制进行表征，构建了代谢物水平与疾病产生的代谢网络。结果发现有53个代谢物的差异表达与更年期综合征代谢紊乱相关，这些代谢物的水平变化可以作为更年期综合征不同症型的诊断标记物。其中，3-吲哚磺酸是首次在更年期综合征动物模型发现的与更年期慢性肾病相关的重要生物标记物。同时，3-吲哚磺酸水平异常还和更年期潮热症状有很大关系。
　　2.本阶段研究首次将烟酰胺、N-甲基烟酰胺、胍基丁胺、亚精胺、精胺选定为指示细胞生长速率下降导致机体衰老的潜在生物标记物，并有待于HPLC-MS/MS靶向代谢组学的进一步验证。
　　3.在贯叶连翘治疗机制研究中，找到与治疗相关的差异表达代谢物共29个。研究揭示了贯叶连翘对更年期综合征治疗作用的主要靶器官为肝脏和脾脏，其次为肾脏。其中，本研究首次发现贯叶连翘对GABA、多巴胺和5-HT受体的调控作用与其对精氨酸、丙酮酸和色氨酸代谢途径的调节有密切关系。尤其是给药后尿样中乙酸水平显著升高，显示出贯叶连翘对丙酮酸代谢途径中乙酸→乙醛酸通路的干预结果。揭示了贯叶连翘一个重要治疗机制是对丙酮酸代谢途径中乙醛脱氢酶2(ALDH2)的调节作用。使ALDH2不仅通过降低氧化应激减少机体炎症和细胞凋亡的发生来降低更年期糖尿病、帕金森病的产生，还能抑制多巴胺降解生成神经毒性化合物3，4-dihydroxyphenylacetaldehyde(DOPAL)而起到脑神经保护作用。
　　这些找到的内源性小分子代谢产物为更年期综合征病理机制解释提供了分子层面的证据，为贯叶连翘治疗机制的研究提供了新的理论依据，说明这种基于多种分析技术与多元统计方法组合的代谢组学研究策略是从代谢物水平研究动物乃至人类内分泌系统疾病及药物疗效评价的有用平台。

目录

声明

缩略词表

摘要

第1章 绪论

1．1 代谢组学的应用与发展

1．1．1 疾病诊断

1．1．2 药物药理学研究

1．1．3 代谢组学在其他学科的应用

1．2 代谢组学与中药整体观念和辩证论治

1．2．1 中药研究和发展

1．2．2 中药活性成分研究

1．2．3 中药经方验方研究

1．3 基于一维核磁共振和液质联用技术技术的发现与靶向代谢组学

1．3．1 1H-NMR在发现(非靶向)和靶向代谢组学中的应用

1．3．2 HPLC-MS／MS在发现(非靶向)和靶向代谢组学中的应用

第2章 贯叶连翘治疗更年期综合征文献系统评价

2．1 引言

2．1．1 中医对更年期综合征的认识和治疗

2．1．2 西医对更年期综合征的认识和治疗

2．2 贯叶连翘治疗更年期综合征文献系统评价与Meta分析

2．2．1 研究对象和方法

2．2．2 结果与讨论

2．3 小结

第3章 更年期综合征动物代谢组学研究方法建立

3．1 更年期模型比较与选择

3．1．1 自发型大鼠／小鼠更年期模型

3．1．2 诱发型大鼠／小鼠更年期模型

3．2 更年期综合征代谢组学研究动物模型建立

3．2．1 材料与方法

3．2．2 造模方法

3．2．3 造模指标测定

3．3 一维核磁共振氢谱(1H-NMR)及高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS／MS)分析参数优化

3．3．1 1H-NMR采集参数优化

3．3．2 HPLC-MS／MS分析参数设定与优化

3．4 常规数据统计及多元统计分析选择

3．4．1 常规数据统计

3．4．2 多元统计方法选择

3．5 生物标记物选择与代谢网络绘制

3．5．1 数据处理方法

3．5．2 数据分析和代谢通路分析

3．6 小结

第4章 自然更年期(衰老)大鼠模型代谢组学研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验动物

4．2．2 仪器与试剂

4．2．3 红外热成像尾温测定

4．2．4 1H-NMR数据分析

4．2．5 HPLC-MS／MS谱分析

4．2．6 统计学分析

4．2．7 代谢通路绘制及解释

4．3 结果与讨论

4．3．1 体重及脏器指标

4．3．2 红外热成像尾温测定结果

4．3．3 1H-NMR数据分析结果

4．3．4 HPLC-MS／MS数据分析结果

4．4 小结

4．4．1 生物氧化呼吸链反应(三羧酸循环、烟酸和烟酰胺代谢及乙醛酸代谢通路)

4．4．2 精氨酸和脯氨酸代谢通路

第5章 更年期综合征代谢组学机制研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验动物

5．2．2 仪器与试剂

5．2．3 模型建立

5．2．4 分组及给药方法

5．2．5 红外热成像尾温测定

5．2．6 样本收集

5．2．7 1H-NMR数据分析

5．2．8 HPLC-MS／MS数据分析

5．2．9 统计学分析

5．2．10 代谢通路绘制及解释

5．3 结果与讨论

5．3．1 体重指标

5．3．2 尼尔雌醇对大鼠尾温影响

5．3．3 子宫内膜组织病理检查

5．3．4 1H-NMR数据分析结果

5．3．5 HPLC-MS／MS数据分析结果

5．3．6 更年期综合征MetPA代谢途径分析

5．4 小结

5．4．1 糖酵解和糖异生

5．4．2 三羧酸循环

5．4．3 脂肪酸生物合成和氧化

5．4．4 蛋氨酸循环

5．4．5 一碳单位途径

5．4．6 尿素循环

5．4．7 与更年期慢性肾病相关的潜在生物标记物发现

5．4．8 尼尔雌醇副作用相关生物标记物发现

第6章 贯叶连翘治疗更年期综合征代谢组机制研究

6．1 引言

6．1．1 抗抑郁作用

6．1．2 抗焦虑作用

6．1．3 抗阿尔茨海默病作用

6．1．4 抗菌抗炎作用

6．1．5 毒理学

6．1．6 药代动力学研究

6．2 贯叶连翘254nm及360nm指纹图谱研究

6．2．1 材料与方法

6．2．2 结果与讨论

6．3 贯叶连翘及主要黄酮类活性成分清除自由基活性研究

6．3．1 材料与方法

6．3．2 结果与讨论

6．4 基于NMR及LC-MS技术研究贯叶连翘治疗大鼠更年期综合征模型的代谢组变化

6．4．1 材料与方法

6．4．2 结果与讨论

6．5 小结

6．5．1 贯叶连翘指纹图谱及抗氧化活性分析

6．5．2 贯叶连翘治疗机制结果

第7章 结论

参考文献

在读期间发表论文及参与科研项目情况

个人简介

附件

致谢