嗜热菌糖苷酶基因牛乳腺特异表达载体的构建及脂质体介导其转染细胞的研究

摘要

利用乳腺生物反应器生产有经济价值的生物活性蛋白已成为当前生物领域研究的热点，制备乳腺生物反应器的关键环节是构建高效、特异的表达载体，而β-乳球蛋白(BLG)是反刍动物乳中主要的乳清蛋白。本研究以牛β-乳球蛋白基因上游调控成分作为启动子，嗜热菌糖苷酶基因lacS为目的基因，构建了lacS基因乳腺特异表达载体，并通过脂质体介导法转染体外培养的牛胎儿成纤维细胞(bFF)，借助新霉素抗性基因(Neo)和增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)来筛选、纯化阳性克隆细胞，为利用核移植技术制备转基因动物提供细胞来源。研究结果如下： 首先，通过PCR技术扩增出0.92kb牛β-乳球蛋白基因5'端调控序列和1.49kb嗜热菌糖苷酶基因编码序列。并将上述序列与pIRES2-EGFP载体及pUC19载体经基因重组构建了乳腺特异表达载体pBLI。使牛β-乳球蛋白基因5'端调控序列启动嗜热菌糖苷酶基因在乳腺中特异表达，而新霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因作为标记基因在人巨细胞病毒启动子指导下非组织特异性表达。 其次，应用组织块培养法从妊娠2～3月的牛胎儿耳部皮肤中分离纯化成纤维细胞。对培养的细胞进行形态学观察、生长曲线测定、S4基因性别检测和G418敏感浓度的测定。结果表明，培养的细胞具有正常形态和生长特性，其供体牛为雌性，G418筛选浓度为800μg/ml，维持浓度为300μg/ml。 最后，以线性化的乳腺特异表达载体pBLI为外源基因，采用脂质体介导法转染牛胎儿成纤维细胞。通过比较不同DNA剂量和脂质体剂量对转染效率的影响，进行转染条件的优化。结果表明：在无血清体系中，80％汇合的bFF用3.0μl脂质体介导1.0μg线性质粒DNA转染5hr，可获得较满意的转染效果；运用此优化体系转染bFF，经终浓度800μg/ml的G418快速筛选7d，可见表达EGFP的2个细胞克隆。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

1前言

2实验一硫矿硫化叶菌（sulfolobus solfataricus）的培养及lacS基因的克隆

3实验二嗜热菌糖苷酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

4实验三牛胎儿成纤维细胞系的建立及性别鉴定

5实验四牛胎儿成纤维细胞的基因转染

6结论

致谢

参考文献

附录

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