Hypodermins A，B，C基因cDNA在大肠杆菌中的表达及牛皮蝇蛆病ELISA诊断方法的建立

摘要

牛皮蝇蛆病是一种危害严重的人畜共患病，每年都给养牛业带来巨大的经济损失。国内外研究表明纹皮蝇Hypoderomin A(HA)，Hypodermin B(HB)和Hypodermin C(HC)是该病血清学诊断和免疫疫苗的候选抗原．由于获得牛皮蝇蛆Ⅰ期幼虫比较困难，利用虫体粗蛋白作为抗原在血清学诊断和免疫防治中的研究越来越少。为了获得较多的、纯化的重组蛋白，本课题进行了牛皮蝇Ⅰ期幼虫三种免疫相关蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化，并建立了牛皮蝇蛆病的ELISA诊断方法，为以后进一步的研究奠定了基础。 本研究从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取总RNA，反转录为cDNA，根据Genbank上的Hypodermins A，B，C基因序列设计上下游引物，PCR扩增HA，HB和HC基因，将PCR产物连接到pMD19-T simple vector载体上并进行序列测定。序列测定正确的目的片段(HA、HB、HC)亚克隆到原核表达载体中构建重组表达载体(pETHA、pETHB、pETHC)并转化到表达宿主菌BL21(DE3)中。以优化的表达条件诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，Western-blotting检测重组蛋白的免疫活性。三种重组表达菌诱导表达后，提取重组蛋白包涵体，经8M尿素变性，透析复性或SEC柱上复性后，再以葡聚’糖凝胶Sephadex G-75进行纯化。分别以虫体粗蛋白和纯化的重组蛋白为检测抗原，建立牛皮蝇蛆病的血清学诊断方法。经研究得到如下结果： 1．从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取了总RNA，用RT-PCR技术扩增获得了HA、HB和HC基因cDNA，大小分别为697bp、697bp和715bp。 2．分别将HA、HB、HC基因cDNA与克隆载体pMD19-T连接，构建了重组克隆载体pTHA、pTHB和pTHC。 3．序列分析表明，HA基因序列同GenBank上公布的两个序列(登录号：L24914，X74303)核苷酸同源性分别为100％和99.71％：氨基酸同源性分别为100％和99.56％。HB基因序列同GenBank上公布的三个序列(登录号：L24915，X74304，X74305)核苷酸同源性分别为98.97％、98.97％和95.74％：氨基酸同源性分别为98.23％、98.23％和93.36％。HC基因序列同GenBank上公布的两个序列(登录号：AB054066，X74306)核苷酸同源性分别为100％和99.42％：氨基酸同源性分别为100％和99.57％，说明本实验所采集的虫株与国外报道的虫株有很高的同源性。 4．成功构建了原核表达载体pETHA、pETHB和pETHC，并实现了HA、HB和HC在大肠杆菌中的表达，重组蛋白均以包涵体的形式存在，表达量分别达到全菌蛋白的35％、30％和30％。 5．Western blotting结果表明，重组蛋白rHA、rHB和rHC能与牛皮蝇蛆感染牛血清IgG特异性结合，表明表达产物具有免疫活性。 6．重组蛋白rHA、rHB和rHC分别以0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的初始浓度透析复性，并在Sephadex G-75层析柱上得到了纯化。 7．对重组蛋白rHA、rHB、rHC在SEC柱上的复性进行了探索性研究，三种重组蛋白均能在SEC柱上复性。 8．分别以虫体粗蛋白和重组蛋白rHC作为检测抗原建立了牛皮蝇蛆病的ELISA检测方法，特异性分别为100％和95.8％，敏感性分别为98.36％和100％。 9．以虫体粗蛋白和rHC建立的ELISA诊断方法检测采集于内蒙古地区的233份牛血清，感染率分别为22.3％(52/233)和20.6％(48/233)。阳性符合率分别为88.46％(46/52)和93.75％(45/48)。 10．本研究以rHC为检测抗原建立的ELISA诊断方法具有较高的特异性和敏感性，在敏感性和阳性符合率方面均优于以虫体粗蛋白建立的ELISA诊断方法。因此rHC可以作为虫体蛋白良好的替代抗原，解决了通过虫体获取抗原蛋白困难的问题。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1引言

1.1国内外牛皮蝇的研究历史

1.1.1国外研究历史

1.1.2国内研究历史

1.2病原种类

1.3牛皮蝇的主要生物学特性

1.3.1牛皮蝇的生活史

1.3.2牛皮蝇幼虫在牛体内的移行规律

1.3.3牛皮蝇的活动规律

1.4牛皮蝇蛆病的地理分布及危害

1.4.1牛皮蝇蛆病的地理分布

1.4.2牛皮蝇及牛皮蝇蛆病的危害

1.5国内外牛皮蝇蛆病防治研究进展

1.5.1药物防治

1.5.2疫苗的研究进展

1.6.牛皮蝇蛆病诊断研究进展

1.6.1临床检查

1.6.2血清学诊断研究进展

1.7包涵体蛋白体外复性研究

1.7.1外源基因在大肠杆菌中的表达

1.7.2包涵体蛋白的形成机制

1.7.3包涵体的分离，洗涤和溶解

1.7.4蛋白质折叠复性的机理

1.7.5蛋白质体外重折叠复性的方法

1.8本研究的主要目的和意义

2试验研究一HypoderminsA,B.C基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

2.1实验材料

2.1.1实验虫体

2.1.2菌株与质粒载体

2.1.3主要的酶和试剂

2.1.4 仪器与设备

2.1.5试剂配制

2.2实验方法

2.2.1引物设计

2.2.2纹皮蝇幼虫总RNA的提取

2.2.3 HA，HB和HC基因的RT-PCR扩增

2.2.4 HA，HB和HC基因的克隆

2.2.5重组表达载体的构建

2.2.6重组表达菌诱导表达条件的优化

2.3实验结果

2.3.1纹皮蝇幼虫总RNA的提取

2.3.2 HA，HB和HC基因RT-PCR扩增

2.3.3重组克隆菌的筛选

2.3.4重组表达菌的筛选

2.3.5核苷酸序列测定与分析

2.3.6重组表达菌诱导表达条件的优化

2.3.7重组蛋白的Western Blotting检测

2.4讨论

2.4.1序列分析

2.4.2 HA，HB，HC基因cDNA在大肠杆菌中的表达

2.4.3 Western blotting检测

3试验研究二 重组蛋白的复性及纯化

3.1实验材料

3.1.1 表达菌株

3.1.2 主要的酶和试剂

3.1.3 仪器与设备

3.1.4 溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1重组蛋白包涵体的制备

3.2.2重组蛋白透析复性

3.2.3重组蛋白的纯化

3.2.4重组蛋白SEC柱上复性及纯化

3.3实验结果

3.3.1重组蛋白包涵体的制备

3.3.2重组蛋白透析复性及纯化

3.3.3重组蛋白SEC柱上复性及纯化

3.4讨论

3.4.1重组蛋白包涵体的制备

3.4.2重组蛋白透析复性及纯化

3.4.3重组蛋白SEC柱上复性及纯化

4试验研究三 牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法的建立

4.1实验材料

4.1.1实验虫体

4.1.2实验仪器

4.1.3实验试剂

4.1.4试剂的配制

4.2实验方法

4.2.1抗原的制备及血清的采集

4.2.2间接ELISA的实验程序

4.2.3间接ELISA最佳反应条件的确定

4.2.4判定点的确定

4.2.5特异性和敏感性的测定

4.2.6抗原阻断试验

4.2.7重复性试验

4.2.8田间血清检测

4.2.9阳性符合率检测

4.3实验结果

4.3.1虫体粗蛋白浓度测定

4.3.2间接ELISA最佳反应条件的确定

4.3.3判定点确立

4.3.4特异性和敏感性的测定

4.3.5抗原阻断实验

4.3.6重复性试验

4.3.7田间血清检测

4.3.8阳性符合率检测

4.4讨论

5结论与展望

5.1结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录

作者简介