猪α、β、γ干扰素在新城疫病毒LaSota株中的高效稳定表达及抗病毒活性研究

摘要

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子，可作为免疫佐剂以提高疫苗的保护效力。一般情况下，天然干扰素难以直接提取纯化和大量制各。猪病毒性疾病在养猪业生产中的危害较大，是影响养猪业健康发展最重要的一类疾病。因此，猪干扰素基因工程制品的研制与开发具有广阔的应用前景。 本研究利用RT－PCR技术克隆了猪干扰素－α基因(PoIFN和－α)和猪干扰素-γ基因(PoIFN-β)，并人工合成了PoIFN-β基因。并以我国自行选育的一株新城疫病毒rLaSota弱毒疫苗株为载体，分别将猪干扰素-α基因(PoIFN-α)、猪干扰素-β基因(PoIFNo-β)和猪干扰素-Y基因(PoIFN-γ)插入NDV LaSota疫苗株基因组P和M基因之间，构建了表达PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ成熟蛋白的重组NDV全基因组cDNA克隆，通过反向遗传操作分别拯救出稳定表达猪干扰素-α、猪干扰素-β和猪干扰素-γ的重组NDV，rL,aSota-PolFN-α、rLaSota-PoIFN-β和rLaSota-PoIFN-γ:通过RT-PCR检测，扩展到目的片段；通过免疫荧光检测，观察到被感染的BHK-21细胞膜上有强的荧光信号:通过western-blot分析，检测到特异反应条带；在BHK-21细胞系中检测重组病毒抗病毒生物学活性，结果表明重组病毒表达的猪干扰素均可以不同程度地抑制VSV-GFP在BHK-21细胞系中的增殖并具有较高的抗病毒活性。干扰素的抗病毒作用与干扰素的浓度呈正相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1引言

1.1干扰素简介

1.1.1 α-干扰素

1.1.2 β-干扰素

1.1.3 γ-干扰素

1.1.4 IFN及其相关基因的表达调控

1.1.5 IFN的抗病毒作用机理

1.2猪干扰素的基因工程

1.2.1猪α干扰素的基因工程

1.2.2猪β干扰素的基因工程

1.2.3猪γ干扰素的基因工程

1.3重组蛋白表达系统简述

1.3.1大肠杆菌表达体系

1.3.2酵母表达体系

1.3.3哺乳动物细胞表达系统

1.4负链RNA病毒反向遗传操作系统及其应用研究

1.5新城疫病毒反向遗传操作系统及其应用研究

1.6研究目的和意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2传代细胞

2.1.3毒种和菌种

2.1.4质粒

2.1.5血清

2.1.6单克隆抗体

2.1.7主要试剂

2.1.8引物

2.1.9主要仪器与耗材

2.2实验方法

2.2.1猪干扰素-α/γ基因克隆与序列分析

2.2.2猪干扰素-β基因的人工合成

2.2.3表达猪干扰素基因的基因组全长cDNA克隆的构建

2.2.4重组病毒的拯救

2.2.5重组病毒的RT-PCR鉴定

2.2.6重组病毒的间接免疫荧光(IFA)检测

2.2.7 Western-blot检测重组病毒PoIFN基因表达

2.2.8重组PoIFN抗病毒活性的测定

3实验结果

3.1猪干扰素-α/γ全基因的克隆及序列分析

3.1.1 PoIFN-α全基因克隆及序列分析

3.1.2 PoIFN-γ全基因克隆及序列分析

3.2表达猪干扰素基因的基因组全长cDNA克隆的构建

3.2.1重组型NDV基因组全长cDNA的构建

3.2.2 pBRN-PoIFN基因组全长cDNA阳性克隆的酶切鉴定

3.2.3 pBRN-PoIFN基因组全长cDNA阳性克隆的PCR鉴定

3.3重组病毒的拯救

3.4重组病毒RT-PCR鉴定

3.5重组病毒的间接免疫荧光(IFA)检测

3.5.1 rLaSota-PoIFN-α的间接免疫荧光检测

3.5.2 rLaSota-PoIFN-β的间接免疫荧光检测

3.5.3 rLaSota-PoIFN-γ的间接免疫荧光检测

3.6 Western-blot检测重组病毒PoIFN基因表达

3.6.1 Western-blot检测重组病毒PoIFN-α基因表达

3.6.2 Western-blot检测重组病毒PoIFN-β基因表达

3.6.3 Western-blot检测重组病毒PoIFN-γ基因表达

3.7重组PoIFN抗VSV-GFP病毒活性检测

3.7.1重组PoIFN-α抗VSV-GFP病毒活性检测

3.7.2重组PoIFN-β抗VSV-GFP病毒活性检测

3.7.3重组PoIFN-γ抗VSV-GFP病毒活性检测

4讨论

4.1 PoIFN基因的克隆

4.2新城疫病毒作为活病毒载体

4.3基因组全长cDNA克隆的构建

4.4重组病毒的拯救

4.5 PoIFN的稳定表达

4.6重组PoIFN抗VSV-GFP病毒活性测定

5结论

致谢

参考文献

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