蒙古冰草抗旱相关基因克隆、表达及RNAi载体构建

摘要

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是我国荒漠草原和典型草原优良的禾本科牧草，具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐瘠薄、抗病虫等优异特性，是牧草和农作物抗性改良的重要基因资源。同时，蒙古冰草是冰草属中珍贵的二倍体物种，不仅具有较高的饲用价值，还具有重要的生态价值和遗传育种价值。我国拥有丰富的蒙古冰草种质资源，开展蒙古冰草抗逆性基因资源的挖掘和利用，对于我国蒙古冰草种质资源的保护和种质创新具有重要意义。本研究以蒙古冰草为材料，开展了以抗旱基因为主的受逆境胁迫表达基因的克隆及其抗逆分子机制研究，主要结果如下： 1.采用PCR和RACE技术，从蒙古冰草中克隆了1个第四组LEA基因，命名为MwLEA。该基因cDNA全长961bp，编码171个氨基酸。具有LEA—4超基因家族N端特征结构域，C端序列不具备保守性，二级结构中α—螺旋占主导，该基因前140个氨基酸的亲水性较强，尾部序列亲水性减弱，受干旱胁迫诱导表达。 2.采用RT—PCR技术，从蒙古冰草中克隆了1个第三组LEA基因家族成员，命名为MwLEA3，基因全长1004bp，包含3个内含子区和3个外显子区，编码189个氨基酸。具有8个重复的11aa—基元序列，氨基酸组成中丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸三种氨基酸约占总量的50％，不含半胱氨酸和色氨酸。二级结构中α—螺旋占主导，亲水性较强，经Southern杂交分析，认为该基因在基因组中以基因家族形式存在。 3.采用RT—PCR方法对MwLEA3基因的表达模式分析显示，该基因在根茎中的表达量高于叶片中的表达量；受干旱、高盐、外源激素ABA的诱导，在植物体内高水平表达。不同诱导条件下的基因表达模式存在差异。为深入研究MwLEA3基因的功能，以MwLEA3基因为靶标构建了RNAi表达载体pRNAiMwLEA3。 4.采用RT—PCR方法从蒙古冰草中克隆到肌动蛋白（Actin）基因，命名为MwACT。在诱导表达分析中，MwACT不受外界因素诱导表达量恒定，是组成型表达的管家基因。为研究其他基因在蒙古冰草中表达提供内标参照。 5.从蒙古冰草中克隆到谷胱甘肽—S—转移酶（GSTs）类基因，命名为MwGSTs，该基因具有GSTs超基因家族保守结构域（C—terminal alpha helical domain）。二级结构和亲疏水性分析表明，MwGSTs基因具有结合疏水底物的H位点和较强的疏水特性。 6.本研究克隆的4个基因均与小麦同类基因高度同源，从遗传进化方面阐明了蒙古冰草进化程度与小麦接近。从理论上支持了蒙古冰草是小麦野生近缘种这一观点，从而确定蒙古冰草为小麦抗性改良基因资源的理想物种。

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论文说明：缩略语表

声明

第一章 文献综述

1引言

2植物抗旱机理的研究进展

2.1植物抗旱的生物学原理

2.2植物抗旱的分子机制

3植物抗性相关基因分离策略

3.1转座子标签技术(transposon tagging)

3.2图位克隆技术(map-based cloning)

3.3同源序列技术

3.4差异表达基因克隆方法

3.5表达序列标签技术(EST)

4蒙古冰草的研究现状

4.1蒙古冰草的生物学特性

4.2蒙古冰草的经济价值

4.3遗传育种研究进展

5研究目的和意义

第二章蒙古冰草MwLEA基因的克隆及序列特征分析

1材料与方法

2结果与分析

2.1蒙古冰草LEA基因片段的分离

2.2 3'RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)和5'RACE

2.3 3'RACE和5'RACE序列拼接及序列特征分析

2.4 MwLEA基因序列同源性比较与聚类分析

2.5 MwLEA基因二级结构特征及亲水性分析

3讨论

第三章蒙古冰草MwLEA3基因的克隆、表达及RNAi表达载体的构建

第一节蒙古冰草MwLEA3基因的克隆及序列特征分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节MwLEA3基因的表达与调控

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节RNAi植物表达载体的构建

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第四章蒙古冰草Actin基因片段的克隆及序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 蒙古冰草Actin基因片段的分离

2.2 Actin基因序列同源性比较与聚类分析

3讨论

第五章蒙古冰草谷胱甘肽-S-转移酶基因同源序列的分离

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 蒙古冰草GSTs基因片段的分离

2.2 GSTs基因片段的序列分析与同源性比较

2.3二级结构特征及亲水性分析

2.4 Southern杂交分析

3讨论

第六章结论与讨论

致谢

参考文献

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