利用过表达对拟南芥液泡H-ATPase c亚基功能的初步研究

摘要

植物液泡H+—ATPase（V—ATPase）是一类特殊的膜转运结合蛋白，广泛分布于植物的液泡膜等内膜系统上。它能水解ATP产生能量、调节pH值、产生跨膜质子电化学势梯度来驱动物质转运；同时，在植物处于逆境时还能通过自身调节使植物适应不良环境得以生存。 拟南芥V—ATPase由13个亚基组成，包括V0和V1两个结构域，c亚基是V0域的重要组成部分之一。现已明确c亚基由五个同源基因编码，研究发现c亚基对逆境的响应更为敏感。本论文获得了拟南芥4个VHA—c基因过表达转基因纯合体植物，并进行了初步分析，结果如下： 1.用半定量RT—PCR对4个基因的纯合转基因植物中目标基因的mRNA表达水平进行了检测，其中：7株VHA—c1纯合转基因植物中有2株mRNA表达水平较高的个体；6株VHA—c3纯合转基因植物中有2株mRNA表达水平较高的个体；9株VHA—c4纯合转基因植株中有7株mRNA表达水平较高的个体；7株VHA—c5纯合转基因植株中有6株mRNA表达水平较高的个体。 2.对过表达纯合体植株的表型分析发现：正常光照培养条件下，所有的VHA—c5过表达纯合体的根的长度变短；而VHA—c1，VHA—c3、VHA—c4过表达纯合体在暗培养5天后，6个VHA—c1株系、5个VHA—c3株系和所有VHA—c4株系的根的长度均短于对照。 3.ABA处理下：4个株系的VHA—c1和3个株系的VHA—c3过表达纯合体的相对根长均大于对照，且子叶的展开程度均高于对照；所有的VHA—c1株系和5个VHA—c3株系过表达纯合体的萌发率均大于对照。 4.在葡萄糖处理下：5个株系的VHA—c1和5个株系的VHA—c3过表达纯合体的萌发率均大于对照；在蔗糖处理下：4个株系的VHA—c1和所有株系的VHA—c3过表达纯合体的萌发率均大于对照。 以上结果表明，c1、c3、c4和c5亚基过表达可能在不同程度上影响了根细胞的扩展；且VHA—c1和VHA—c3基因的过表达导致转基因纯合体种子萌发和根伸长对ABA的抑制不敏感，并对葡萄糖和蔗糖对种子萌发的抑制不敏感，暗示V—ATPase可能参与了ABA和糖介导的信号转导途径。

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文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

1引言

1.1液泡H+-ATPase的研究进展

1.1.1液泡H+-ATPase的结构和组成

1.1.2液泡H+-ATPase的功能

1.1.3液泡H+-ATPase c亚基的结构及功能

1.1.4拟南芥液泡H+-ATPase c亚基的相关研究

1.2研究目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3试剂

2.2实验方法

2.2.1植物培养

2.2.2 VHA-c基因过表达载体的构建

2.2.3植物表达载体的农杆菌转化

2.2.4转基因植物的获得及纯合体的获得

2.2.5过表达转基因植物的分子鉴定

2.2.6过表达转基因植物的表型分析

3结果与分析

3.1 VHA-c基因过表达载体的构建

3.1.1PCR扩增VHA-c1～c5目的片段

3.1.2植物表达重组质粒 pCHF3-cn的构建

3.2 重组质粒pCHF3-cn转化农杆菌

3.3转基因植株的筛选

3.4过表达纯合体目标基因转录水平的检测

3.4.1拟南芥转基因纯合体植株总RNA的提取

3.4.2转基因纯合体植株目标基因过表达水平的半定量RT-PCR检测

3.5部分转基因纯合体表型分析和处理

3.5.1表型分析

3.5.2暗培养条件下过表达纯合体根的变化

3.5.3ABA处理下过表达纯合体根伸长和种子萌发的变化

3.5.4不同糖浓度处理下过表达纯合体种子萌发率的变化

4结论与讨论

4.1 V-ATPase在细胞扩展中的作用

4.2VHA-c基因与ABA的关系

4.3VHA-c基因与光和激素的关系

4.4VHA-c1和VHA-c3种子萌发与糖和ABA的关系

4.5结论

致 谢

参考文献

作 者 简 介