沙棘木蠹蛾白僵菌高毒菌株筛选和几丁质酶基因克隆及其微胶囊制剂的研究

摘要

沙棘（Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi）是我国黄土丘陵区生态建设、经济树种之一，在内蒙古、辽宁等地分布面积广。沙棘木蠹蛾（Holcocerus hippophaecolus Hua，Chou，Fang et Chen）钻蛀危害沙棘干和根部，造成沙棘大面积死亡。球孢白僵菌(Beauveria. bassiana)侵染沙棘木蠹蛾幼虫和蛹，导致其死亡。为更好利用白僵菌防治沙棘木蠹蛾，本文从菌株筛选、酶活性、几丁质酶基因克隆、分生孢子萌发促进剂、微胶囊研制及其生物测定等方面对寄生于沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌进行了比较系统的研究，主要内容包括：
　　1.白僵菌菌株筛选：从病死沙棘木蠹蛾幼虫和蛹中分离纯化得到5株球孢白僵菌菌株。室内通过比较生长速度、产孢量、萌发速度、不同温、湿度下的分生孢子萌发率、对高温的耐性、抗紫外线照射等方面筛选优良菌株。结果表明，SJ-05菌株的各项生长指标较优秀。SJ-05在76％的湿度下萌发率为60％，是SJ-03的2.5倍。50℃高温胁迫18 min，SJ-05的萌发率为48.77%，是SJ-03的2.5倍。紫外线持续照射8 h，SJ-05萌发率最高为33.92%是SJ-02的2.0倍。表明SJ-05菌株抗低湿能力、耐热性和抗紫外照射能力强，为优良菌株。
　　2.白僵菌菌株酶活性及几丁质酶基因克隆：采用平板测定法和Lowry及DNS测定法对白僵菌菌株胞外蛋白酶和几丁质酶活性进行测定。优良菌株SJ-05胞外蛋白酶产量为55.3 U/mL，几丁质酶产量为137.9 U/mL，分别是菌株SJ-01的3.5倍和4.3倍。克隆得到球孢白僵菌几丁质酶基因，其核苷酸序列阅读框架全长1047 bp，编码348个氨基酸。推测其分子量为36.9 KDa，等电点为5.94，可能是从球孢白僵菌中克隆的一新几丁质酶基因。
　　3.营养液、酸碱度、继代培养及促进剂对 SJ-05孢子萌发的影响：1%蛋白胨、1%蔗糖和1%蚕蛹表皮3种营养液都可促进孢子萌发。孢子萌发最适pH值为6.0～7.0。培养第5代后，SJ-05分生孢子的萌发率、萌发速度均明显下降，培养16h时，第3代的萌发率为97%，第4代的萌发率为87%，第5代的萌发率仅为40%。AA、BB两种促进剂对白僵菌分生孢子的萌发有明显促进作用，并随浓度的增大对孢子萌发的促进作用均有不同程度的增强，培养14 h和18 h时，1.5 ppm AA、BB两种促进剂中孢子萌发率高，分别为46%和96%，分别是对照组的2.6倍和2.5倍。促进剂CC对分生孢子萌发率的促进作用不明显，高浓度时有一定抑制作用。
　　4.微胶囊的研制与性能测定：用界面聚合法对SJ-05分生孢子制备微胶囊，通过4因素4水平正交试验，C含量100%、E含量0.5%、F浓度0.5 M、转速500 r/min是制备微胶囊的最优组合。在61%湿度下，SJ-05微胶囊孢子萌发率为33.85%，分生孢子菌悬液不萌发。微胶囊与分生孢子悬液经30W、40cm处紫外线照射后的孢子萌发率均下降，但是微胶囊有一定的抗紫外能力。紫外照射10 h，微胶囊孢子萌发率26.91%，分生孢子悬液孢子萌发率仅3.92%。
　　5.生物测定：室内模拟野外条件，SJ-05分生孢子及微胶囊对沙棘木蠹蛾幼虫的的致死率分别为45.54%和84.54%，说明SJ-05微胶囊对沙棘木蠹蛾幼虫的侵染明显高于其分生孢子。同时，室内测定SJ-05对枸杞负泥虫幼虫、落叶松毛虫幼虫及沙棘木蠹蛾幼虫的侵染，SJ-05分生孢子对三种害虫幼虫的LC50分别为3.45×107个孢子/mL、2.92×107个孢子/mL和9.79×106个孢子/mL，SJ-05微胶囊对落叶松毛虫幼虫和沙棘木蠹蛾幼虫的LC50分别为1.03×107个孢子/mL和2.95×106个孢子/mL。分离自感病沙棘木蠹蛾幼虫的菌株对沙棘木蠹蛾幼虫的致死中浓度低，侵染率强。比较相同浓度分生孢子及微胶囊对同种昆虫的侵染率，微胶囊的更强。

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1 引言

1.1 白僵菌的分类地位及形态特征

1.2 白僵菌的生物学特性

1.3 白僵菌水解酶类

1.4 白僵菌的致病机理

1.5 影响白僵菌致病力的因素

1.6 展望

1.7 研究目的、意义及技术路线

2 球孢白僵菌菌株的分离及筛选

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3 球孢白僵菌胞外蛋白酶、几丁质酶的活性测定

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

4 营养液、酸碱度、继代培养及促进剂对SJ-05分生孢子萌发的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5 SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

5.1 材料与方法

9.7μL

5.2 结果与分析

5.3 讨论

6 微胶囊的研制

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

7 SJ-05分生孢子菌悬液及其微胶囊对不同昆虫的毒力

7.1 材料与方法

7.2 结果与分析

7.3 讨论

8 结论与创新点及今后研究方向

8.1 结论

8.2 创新点

8.3 今后的研究方向

致谢

参考文献

作 者 简 介