枯草芽孢杆菌S-16抑制核盘菌形成活性物质的鉴定及其相关功能基因的克隆

摘要

向日葵菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary.)侵染所引起的一种向日葵毁灭性病害。目前，抗病品种选育、农业防治、化学防治等对该病害均无有效防治效果。因此本课题组从生物防治着手，对向日葵菌核病的防治进行了系列的研究。以课题组已分离得到的，对核盘菌（S.sclerotiorum）有显著抑菌效果的枯草芽孢杆菌S-16为材料，对其抗菌活性物质的理化性质、气体抑菌物质的组分、不同的培养条件对核盘菌生长影响等进行研究;并利用质粒pHV1249（包含mini-Tn10）进行电击转化，构建突变子库;同时对突变子的生物膜的形成能力进行了研究。目的是找到抑菌物质产生的相关基因，为枯草芽孢杆菌工程菌的改造提供一定的理论依据。具体研究结果如下：
　　⑴构建了3000个突变子库，并从中筛选到了3株丧失抑菌能力的突变子;同时也筛选到1株丧失产生气体抑菌物质的突变子;从随机挑选的200株突变菌株中找到6株丧失形成生物能力的菌株。
　　⑵抗菌活性物质理化性质的研究。40 mL（100 mL三角瓶）的装液量，分别以葡萄糖和牛肉浸膏为碳、氮源时最有利于抑菌物质的产生，同时S-16的抑菌粗提物的抑菌活性最高;抑菌物质的热稳定性较高，对蛋白酶较为稳定，较耐酸不耐碱，紫外照射处理对于抑菌活性的影响不明显。根据以上结论，初步推断枯草芽抱杆菌S-16的抑菌物质的主要成分为脂肽类物质。
　　⑶探究气体抑菌物质的组分。(1)1-Butanamine，N-methyl-（N-甲基正丁胺）、2-Hexynoic acid（乙炔酸）、3-Butenamide（正丁胺）、Cyclobutanol（环丁醇）、2-Octanamine（正辛胺）和Benzothiazole，2-methyl-（2-甲基苯并噻唑）能够完全抑制核盘菌菌丝的生长。(2) Formamide，N-ethyl-N-phenyl-（N，N-二甲基甲酰胺）、Piperazine，2-methyl-（2-甲基丙酰胺）影响菌丝正常生长，造成菌丝黄化，但是并不影响菌核形成。(3) Ethyne，fluoro-（十二烷基甲铵）和3，3-Dimethyl-4-methylamino-butan-2-one（3，3-二甲基-4-甲氨基丁酮），对核盘菌菌丝和菌核影响较小，只是造成菌丝稀疏，但是不会影响菌核的形成。实验结果表明，抑菌气体中含有多个可以抑制核盘菌菌丝和菌核形成的成分。
　　⑷不同培养条件对核盘菌生长的影响。核盘菌生长最适的培养基是PSA，最适的碳源、氮源分别为蔗糖和硝酸铵，在以碳酸铵为氮源培养的核盘菌，菌丝生长情况较差，其培养条件下的核盘菌并不产生菌核原基和菌核。核盘菌的生长情况随着培养基体积和含糖量的增多。偏酸性条件下较有利于核盘菌菌丝的生长及菌核的产生，其中，pH6为最适宜核盘菌生长的pH。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 向日葵及菌核病简介

1．1．1 向日葵及其病害概况

1．1．2 向日葵菌核病的分布危害

1．1．3 向日葵茵核病的病原菌及症状

1．2 核盘菌的致病机理

1．3 菌核病的防治措施

1．3．1 化学防治

1．3．2 农业防治

1．3．3 向日葵抗性品种选育

1．3．4 生物防治

1．4 枯草芽孢杆菌作为生防菌株的应用

1．4．1 枯草芽孢杆菌的抑菌机制

1．4．2 枯草芽孢杆菌产生的抑菌物质

1．4．3 枯草芽孢杆菌产生的挥发性气体抑菌物质

1．5 Tn10转座子

1．6 研究的目的和意义

2 菌株S-16突变子库的构建及相关基因定位

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 抗生素的配制及其浓度

2．1．3 培养基

2．1．4 主要药品及主要仪器

2．1．5 PCR引物

2．1．6 溶液、缓冲液及试剂

2．1．7 碱裂解提取质粒所需试剂

2．1．8 DNA提取试剂

2．2 实验方法

2．2．1 碱裂解法提取质粒

2．2．2 细菌总DNA的提取

2．2．3 S-16菌株突变体库的构建

2．2．4 抑菌缺失突变子的筛选

2．2．5 抑菌突变株中转座子插入位点侧翼序列的克隆

2．2．6 突变子生物膜的定量测定及生物膜缺失突变子的筛选

2．2．7 抑制菌核形成气体物质缺失突变子筛选

2．3 结果与分析

2．3．1 S-16菌株突变体库的构建

2．3．2 抑菌缺失突变子的筛选

2．3．3 抑菌突变株中转座子插入位点侧翼序列的克隆

2．3．4 突变子生物膜的定量测定及生物膜形成能力缺失突变子的筛选

2．3．5 抑制菌核形成气体物质缺失突变子筛选

2．4 结论与讨论

3 S-16抑菌活性物质的研究

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 抑菌物质粗提液的制备

3．2．2 抑菌粗提液对核盘菌的拮抗作用

3．2．3 抑菌物质的热稳定性测定

3．2．4 不同pH对抑菌活性物质的影响

3．2．5 紫外线对抑菌活性物质的影响

3．2．6 不同酶处理对抑菌活性物质的影响

3．2．7 不同通气量对抑菌物质产生的影响

3．2．8 不同碳、氮源对抑菌物质的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 抑菌粗提液对核盘菌的拮抗作用

3．3．2 抑菌物质的热稳定性研究

3．3．3 不同pH对抑菌活性物质的影响

3．3．4 紫外线对抑菌活性物质的影响

3．3．5 不同酶处理对抑菌活性物质的影响

3．3．6 不同通气量对抑菌物质产生的影响

3．3．7 不同碳、氮源对抑菌物质的影响

3．4 结论与讨论

4 菌株S-16抑菌气体的测定

4．1 实验材料

4．1．1 培养基

4．1．2 供试菌株

4．2 实验步骤

4．2．1 S-16产生的气体对核盘菌的抑制效果

4．2．2 挥发物质的收集与GC-MS测定

4．2．3 挥发性物质具体组分对核盘菌抑制作用

4．3 结果与分析

4．3．1 S-16产生气体对核盘菌的抑制效果

4．3．2 挥发性物质的收集与GC-MS测定

4．3．3 挥发性气体各组分物质对核盘菌抑制作用

4．4 结论与讨论

5 不同培养条件对核盘菌菌核形成及生长情况的影响

5．1 实验材料

5．1．1 培养基

5．1．2 供试菌株

5．2 实验方法

5．2．1 不同培养基种类对核盘菌生长情况的影响

5．2．2 不同碳源对核盘菌生长情况的影响

5．2．3 不同氮源对核盘菌生长情况的影响

5．2．4 不同PDA培养基厚度对核盘菌生长情况的影响

5．2．5 PDA培养基中不同葡萄糖含量对核盘菌生长情况的影响

5．2．6 不同pH对核盘菌生长情况的影响

5．3 结果与分析

5．3．1 不同培养基种类对核盘菌生长情况的影响

5．3．2 不同碳源对核盘菌生长情况的影响

5．3．3 不同氮源对核盘菌生长情况的影响

5．3．4 不同PDA培养基体积对核盘菌生长情况的影响

5．3．5 PDA培养基中不同葡萄糖含量对核盘菌菌核形成及生长情况的影响

5．3．6 不同PH对核盘菌菌核形成及生长情况的影响

5．4 结论与讨论

6 结论

致谢

参考文献

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