内蒙古两个绵羊品种肉质候选基因的组织表达、SNPs检测及其与肉质的相关性研究

摘要

内蒙古大草原孕育了很多肉质鲜嫩的绵羊品种，巴美肉羊、苏尼特羊是其中杰出的代表。肉质是一个重要的经济指标，MyoG、Myf5、Myf6、、CAST基因和MSTN基因被认为是影响肉质的重要的候选基因。实验分析了这些基因的表达量与肉质的相关性以及多态性对肉质的影响，实验结果将为巴美肉羊、苏尼特羊这些优良品种的选育、合理开发利用提供科学的理论依据。
　　采用real-time PCR技术对不同月龄巴美肉羊(40只)、苏尼特羊（42只）中MyoG、Myf5、Myf6、CAST和MSTN基因的表达规律、种间差异及基因表达量与肉质的相关性进行了研究。采用PCR-SSCP技术对101只巴美肉羊、107只苏尼特羊的钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)基因进行了多态性分析，找到其突变位点，并对基因型与肉质的相关性进行了研究。测定的肉质指标包括嫩度、pH、色差、眼肌面积。
　　结果发现:
　　1.(1)巴美肉羊背最长肌中，Myf5基因表达量4、6月龄和12月龄的差异显著，12月龄＞4月龄＞6月龄;苏尼特羊背最长肌中，8月龄Myf5基因表达量显著高于5月龄;6、8月龄的苏尼特羊臂三头肌中Myf5基因的表达量显著高于背最长肌。(2)巴美肉羊臂三头肌中Myf6基因的表达量显著高于苏尼特羊。(3)苏尼特羊CAST基因在6、8、12月龄时，三个部位中的表达量均高于巴美肉羊;8月龄时，苏尼特羊臂三头肌中的CAST基因的表达量显著高于巴美肉羊。(4)①苏尼特羊6月龄背最长肌和股二头肌中的表达量显著高于巴美肉羊;苏尼特羊12月龄背最长肌中的表达量显著低于巴美肉羊。②巴美肉羊臂三头肌和股二头肌中MSTN在4月龄时表达量最高，背最长肌中MSTN基因的表达量一直升高;12月龄时，三个部位中MSTN的表达量基本相同。③苏尼特羊的三个测试部位中MSTN基因的表达规律相同，6月龄最高，12月龄降到最低，三个部位中臂三头肌的表达量最高。
　　2.巴美肉羊和苏尼特羊6、8、12月龄的基因表达量与肉质相关性如下:(1)在苏尼特羊的在臂三头肌中，Myf5基因表达量与剪切力呈显著正相关。在苏尼特羊的臂三头肌中，My f6基因表达量与pH2呈极显著负相关。在股二头肌中，Myf6基因表达量与pH2呈极显著负相关。(2)在巴美肉羊的股二头肌中，CAST基因表达量与剪切力呈显著正相关;苏尼特羊的背最长肌中CAST基因表达量与红度值呈显著负相关。(3)巴美肉羊背最长肌中的MSTN基因表达量与眼肌面积呈显著正相关;与亮度值呈显著负相关。
　　3.各个基因表达量的相关性如下:(1)巴美肉羊背最长肌中，MyoG与Myf6基因的表达量呈显著负相关关系。(2)在两个品种的所有测试部位中，Myf5与Myf6的表达量均为正相关关系，其中巴美肉羊臂三头肌中的Myf5和Myf6的表达量呈显著正相关。(3) Myf6与CAST基因在两个品种的三个测试部位中均表现为正相关性。(4)在苏尼特羊的三个部位中，各个基因表达量的相关性不显著。
　　4.巴美肉羊、苏尼特羊基因分型发现:(1) CAST基因的第六外显子区存在三种基因型:AA、AB和AC型。巴美肉羊群体中多态信息含量为0.30;苏尼特羊群体中多态信息含量为0.28，均为中度多态。CAST基因第六外显子检测到2个突变位点，56bp处发生了A/G碱基替换，在184bp处出现了A/C碱基替换。
　　5.CAST基因基因型与肉质的相关性研究中发现:6月龄巴美肉羊三各基因型的红度值存在显著性差异，AB型＞AA型＞AC型。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 内蒙古绵羊的简介

1．2 肉质

1．3 肉质相关基因的研究进展

1．3．1 生肌决定基因(MyoD)家族

1．3．2 钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因

1．3．3 肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN，GDF-8)

1．4 实时定量技术

1．4．1 实时定量PCR技术原理

1．4．2 管家基因的选择

1．4．3 引物的设计原则

1．5 PCR-SSCP分子标记技术

1．6 本研究的目的、意义及内容

2 材料与方法

2．1 试验动物肉样及血样的采集

2．2 实验仪器及设备、试剂及其配制方法

2．2．1 实验仪器及设备

2．2．2 试剂盒、试剂及酶

2．2．3 试验主要试剂的配制

2．2．4 试验常用分子生物学数据库及软件

2．2．5 引物设计

2．3 试验方法

2．3．1 肉质指标的测定

2．3．2 实时定量试验方法

2．3．3 DNA多态性试验方法

2．3．4 技术路线

2．4 数据分析

2．4．1 实时定量PCR数据分析方法

2．4．2 PCR-SSCP数据分析方法

3 结果与分析

3．1 Real-time PCR试验结果

3．1．1 RNA提取结果

3．1．2 实时定量PCR反应产物结果

3．1．3 测序验证实时定量PCR引物

3．1．4 扩增效率曲线

3．1．5 融解曲线分析

3．1．6 扩增曲线分析

3．1．7 基因表达发育规律

3．1．8 巴美肉羊、苏尼特羊肉质测定结果

3．1．9 巴美肉羊、苏尼特羊不同部位基因表达量与肉质的相关性分析

3．1．10 巴美肉羊、苏尼特羊不同部位各个基因间表达量的相关性分析

3．2 PCR-SSCP试验结果

3．2．1 基因组DNA提取结果

3．2．2 CAST基因PCR结果

3．2．3 CAST基因SSCP分型分型结果

3．2．4 CAST基因型测序比对结果

3．2．5 群体遗传学分析

3．2．6 基因型与肉质性状的相关性

3．2．7 12月龄巴美肉羊、苏尼特羊CAST基因型间肉质的比较

4 讨论

4．1 肉质相关候选基因表达发育规律、种间差异

4．1．1 MyoG、Myf5、Myf6基因的表达发育规律及种间差异

4．1．2 CAST基因的表达发育规律及种间差异

4．1．3 MSTN基因的表达发育规律及种间差异

4．2 巴美肉羊、苏尼特羊各个基因的表达量与肉质的相关性

4．2．1 MyoG的表达量与肉质的相关性

4．2．2 Myf5的表达量与肉质的相关性

4．2．3 Myf6的表达量与肉质的相关性

4．2．4 CAST的表达量与肉质的相关性

4．2．5 MSTN的表达量与肉质的相关性

4．3 各个基因的表达量间的相关性

4．4 CAST基因多态性与肉质的相关性讨论

5 结论创新点及展望

5．1 结论

5．1．1 基因表达规律、种间差异

5．1．2 基因表达量与肉质相关性结论

5．1．3 各基因表达量的相关性

5．1．4 CAST基因多态与肉质相关性结论

5．2 创新点

5．3 展望

致谢

参考文献

附录

作者简介