绒山羊淋巴细胞有丝分裂中期化的条件摸索及Y染色体的微分割研究

摘要

绒山羊属于绒、肉、皮兼用型品种，具有极高的经济价值，接受了长达数年的自然进化以及人类在生产繁育过程中改良出来的，在一些特定的生态环境之中生存，属于重要的家畜资源。由于目前的生态环境恶化，绒山羊的生长条件渐渐恶化，导致优质种羊匮乏且产绒质量下降，因此加强绒山羊的品质已经迫在眉睫。雄性的绒山羊在繁殖后代过程中其遗传基因对后代有很大的影响，而且由于它的产绒量本身极高，因此培育出产绒性状好的优良种山羊意义十分重大。然而想要培育优良性状的种山羊离不开Y染色体的研究，世界上至今还未完成山羊Y染色体测序，因此获得绒山羊的纯度较高的Y染色体至关重要。为此，本研究通过激光显微切割系统成功的获取纯度较高的绒山羊的Y染色体。
　　实验通过分离培养外周血淋巴细胞，用试剂PHA（植物血球凝集素）和ConA（刀豆蛋白A）对淋巴细胞进行刺激培养，培养一定时间后加秋水仙素使淋巴细胞停滞在G2/M期，对这一过程的各个环节的条件进行摸索，找出能够富集大量有丝分裂中期细胞的最佳条件。收集大量处于中期的细胞制备很好的染色体核型，使用激光显微切割系统获得Y染色体。
　　1.淋巴细胞中期化的条件摸索
　　(1)不经过任何刺激的淋巴细胞培养48h时收集，经流式细胞仪检测G2/M期所占比例仅为0.06％。
　　(2)用PHA和ConA刺激淋巴细胞增殖，通过流式细胞仪检测结果可知:ConA的刺激效果较PHA好，且PHA刺激淋巴细胞增殖的最佳浓度为60ug/ml，而ConA刺激淋巴细胞增殖的最佳浓度为5ug/ml.
　　(3)不同的培养时间加秋水仙素使淋巴细胞停滞在G2/M期，结果表明在淋巴细胞培养45h加秋水仙素的效果最好，流式细胞仪检测结果为52.8％。
　　(4)秋水仙素作用于淋巴细胞的时间延长到5h后，流式细胞仪的检测结果G2/M期比例最高为58.38％。说明秋水仙素适当延长可使更多的细胞处于G2/M期。
　　2.染色体的显微切割
　　淋巴细胞培养后做好染色体核型，用显微镜的激光显微切割系统进行Y染色体切割。通过对淋巴细胞G2/M期的摸索，在淋巴细胞培养45h时加秋水仙素处理5h收集细胞，利用膜玻片进行染色体核型制备，染色体核型较多，膜玻片用于染色体显微切割。在蔡司显微镜下找到分散较好的染色体核型并且确定了目标染色体后，并使用激光显微切割系统切割完整的Y染色体。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 内蒙古绒山羊的发展现状

1．2 单条染色体的微分割

1．3 淋巴细胞周期

1．3．1 淋巴细胞周期G2／M期

1．3．2 淋巴细胞G2／M期探索的意义

1．4 染色体显微切割的概述

1．4．1 染色体显微切割技术的建立

1．4．2 染色体微分割的原理和方法

1．4．3 染色体显微切割技术的研究现状

1．4．4 染色体显微切割应用前景

1．5 本研究的目的和意义

2 研究一：淋巴细胞的分离和培养以及淋巴细胞G2期的条件探索

2．1 淋巴细胞的分离和培养

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法与步骤

2．2 淋巴细胞G2期的条件探索

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验步骤

3 研究二： 膜载玻片制备染色体核型和绒山羊Y染色体的显微切割

3．1 膜载玻片制备染色体核型

3．1．1 实验材料

3．2 绒山羊Y染色体的显微切割

3．2．1 染色体膜载玻片的处理

3．2．2 染色体显微切割系统软件的调试

4 结果

4．1 淋巴细胞的分离和培养

4．2 淋巴细胞G2／M摸索结果

4．2．1 正常细胞G2／M期比例

4．2．2 不同作用浓度的PHA和ConA作用下G2／M期所占比例

4．2．3 不同的培养时间加秋水仙素处理下G2／M期所占比例

4．2．4 在44 h附近的时间点加秋水仙素处理淋巴细胞后检测G2／M期所占的比例

4．2．5 不同的秋水仙素作用时间下G2／M期所占比例

4．3 膜玻片制备染色体核型结果

4．4 Y染色体显微切割结果

4．5 激光显微切割的单条染色体

5 讨论

5．1 淋巴细胞的分离和培养

5．2 淋巴细胞有丝分裂中期化的条件摸索

5．2．1 不同的刺激剂对淋巴细胞周期中期化的作用研究

5．2．2 刺激剂的作用浓度对淋巴细胞周期中期化的作用研究

5．2．3 不同的培养时间点加秋水仙素处理对细胞周期中期化的影响

5．2．4 分析秋水仙素的作用时间对淋巴细胞G2／M期的比例的影响

5．3 染色体核型制备的因素

5．4 影响染色体显微切割主要因素

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

致谢

参考文献

作者简介