金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺细胞几种生长因子表达及其信号机制作用的研究

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是引起奶牛乳腺炎的一种重要的革兰氏阳性菌，因其对奶牛乳腺持续性感染，造成乳腺组织损伤和增生性变化，使奶牛乳腺泌乳量降低或失去泌乳功能而最终被淘汰。关于S.aureus引起奶牛乳腺炎的研究主要集中在病原、诊断、治疗和炎性细胞因子的调控方面，对于乳腺纤维化的研究少。S.aureus感染机体后，被宿主细胞细胞膜上模式识别受体（PPRs）识别，激活下游信号转导通路中核转录因子-κB（Nuclear Factor kappaB，NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1），诱导生长因子及细胞因子等产生。本文通过研究S. aureus对奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）和奶牛乳腺成纤维细胞（BMFB）TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其相应受体TβRI、FGFR2和PDGFRβ表达的作用，以及对TLR2、TLR4、NF-κB和AP-1表达的影响，以探讨S.aureus引起奶牛乳腺炎纤维化的发病机理。
　　本试验采用不同浓度的热灭活的S.aureus（0 CFU/mL、105CFU/mL、106 CFU/mL和108 CFU/mL）作用于体外培养的BMEC和BMFB，于不同的时间点（6 h、12 h、24 h和48h）提取细胞的总RNA和总蛋白，采用实时荧光定量PCR法（qPCR）和Western-blot方法检测TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其相应受体TβRI、FGFR2、PDGFRβ的mRNA和蛋白表达水平；采用qPCR和Western-blot方法检测TLR2和TLR4的mRNA和蛋白表达水平；采用Western-blot方法检测NF-κB和AP-1的磷酸化蛋白表达水平；使用NF-κB和AP-1特异性抑制剂L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC)和Sp-600125（1,9-pyrazoloanthrone anthrapyrazolone）对核转录因子活性抑制，再用105CFU/mL的热灭活S. aureus菌液作用细胞，采用qPCR和Western-blot方法检测TGF-β1、bFGF、PDGF-BB的mRNA和蛋白表达。实验数据运用SPSS19.0软件进行Anova双因素方差处理分析组间差异性，运用GraphPad Prism5数据分析软件进行相关性分析。
　　结果表明：
　　（1）S.aureus对BMEC和BMFB TGF-β1、bFGF、PDGF-BB、TβRI、FGFR2和PDGFRβ的mRNA和蛋白的表达基本起促进作用。BMEC TGF-β1、bFGF、PDGF-BB、TβRI、FGFR2和PDGFRβmRNA的表达均呈正时效关系，蛋白的表达均是随着作用时间延长而升高，但是在作用后期升高趋势渐缓。BMFB TGF-β1、bFGF、PDGF-BB、TβRI、FGFR2和PDGFRβ的mRNA先随着S.aureus作用时间的延长表达量呈升高趋势，然后升高趋势渐缓，蛋白的表达呈正时效关系。BMEC和BMFBTβRI、FGFR2、PDGFRβ的表达和TGF-β1、bFGF、PDGF-BB的产生在一定的时间内有极显著的相关性。
　　（2）S.aureus对BMEC和BMFBTLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表达也起到促进作用，BMEC TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表达均呈正时效性；BMFBTLR2、TLR4 mRNA的表达呈正时效性，TLR2蛋白表达呈正时效性，TLR4蛋白呈负时效性。S.aureus显著促进了BMEC和BMFB p-NF-κB-p65和p-c-jun蛋白的表达，基本呈正时效关系。
　　（3）NF-κB和AP-1的特异性抑制剂能显著抑制BMEC和BMFBTGF-β1、bFGF和PDGF-BB mRNA和蛋白的表达水平。
　　（4）TGF-β1、bFGF和PDGF-BB mRNA及蛋白的表达与TLR2、TLR4、NF-κB和AP-1的表达有显著的相关性。
　　本研究证实：
　　S.aureus能够促进BMEC和BMFBTGF-β1、bFGF、PDGF-BB、TβRI、FGFR2和PDGFRβ以及TLR2、TLR4、NF-κB和AP-1的表达，TGF-β1、bFGF和PDGF-BB的产生及分泌与TLRs-NF-κB和TLRs-AP-1信号转导通路有显著的相关性，本研究初步明确了金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞和奶牛乳腺成纤维细胞产生纤维化相关细胞生长因子的分子机理。

目录

缩 略 语 表

1 引言

1.1S. aureus对奶牛乳腺的致病性

1.2 TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其受体的生物学特性以及在组织器官纤维化中的作用

1.3 研究目的和意义

2S. aureus对BMEC TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其相应受体表达及信号转导通路的影响

2.1S. aureus对BMEC TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其相应受体表达的影响

2.2TLR-NF-κB和TLR-AP-1信号转导通路在S. aureus促进BMECTGF-β1、bFGF和PDGF-BB表达中的作用

2.3S. aureus作用于BMEC后TGF-β1、bFGF和PDGF-BB与TLRs信号转导通路的相关性分析

2.4 讨论

2.5 结论

3.1S. aureus对BMFB TGF-β1、bFGF、PDGF-BB及其相应受体表达的影响

3.2TLRs-NF-κB和TLRs-AP-1信号转导通路在S. aureus促进BMFB TGF-β1、bFGF和PDGF-BB表达中的作用

3.3S. aureus作用BMFB后TGF-β1、bFGF和PDGF mRNA和蛋白表达与TLRs信号转导通路的相关性

3.4 讨论

3.5 结论

4 全文结论

5 创新点

致谢

参考文献

作 者 简 介