四跨膜蛋白CD9在绵羊卵母细胞、早期胚胎、卵巢及附睾中的表达研究

摘要

四次跨膜蛋白（tetraspanins）家族是一个大的、进化上高度保守的细胞表面蛋白。它们利用自身强大的趋向性，与周围另一些相关分子相互作用进而形成广阔的分子互作网络结构，对细胞分化、迁移、黏附、凝集、溶解和信号转导等基本的细胞生理过程进行调控。Tetraspanins可引起恶性肿瘤、免疫系统和传染性疾病，所以它们成为治疗这些疾病潜在的目标。CD9（ Cluster-of-differentiation antigen9）是四次跨膜蛋白家族成员之一，是一种细胞膜糖蛋白。它能与其他蛋白质相互作用，如整合蛋白、免疫球蛋白、蛋白聚糖、补体调节蛋白、生长因子受体等。CD9被认为是一种多蛋白复合体，在哺乳动物精卵融合和早期胚胎发育过程中的关键作用备受人们的关注。本研究以绵羊卵母细胞总RNA为模板，采用RT-PCR和实时定量PCR技术，检测了CD9在羊卵母细胞、早期胚胎中的表达量；通过免疫组化、免疫荧光染色和免疫印迹法，检测CD9在绵羊卵巢组织、附睾组织及卵母细胞上的表达情况。利用IVF技术，检测CD9特异性抗体对绵羊精卵结合及融合的影响。通过上述研究方法得到如下几点结果:
　　1.CD9 mRNA在绵羊卵母细胞和早期胚胎中的表达
　　采用RT-PCR和实时定量PCR法检测CD9 mRNA时，在GV期和MⅡ期卵母细胞上均有表达，且MⅡ期表达量比GV期多。在2、4、8-细胞早期胚胎中均有表达，2-细胞胚表达量最多，其次是8-细胞期胚，4-细胞胚的表达量最少。
　　2.CD9蛋白在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中的表达
　　CD9蛋白的免疫荧光染色检测结果发现，GV期和体外成熟卵母细胞上检测到绿色荧光，着色部位于在膜下区域；体外培养的2、4、8-细胞早期胚胎的卵裂球上均检测到绿色荧光。再用免疫印迹法，检测卵母细胞和体外受精早期胚胎中的表达结果显示，在GV期和MII期及早期胚胎中均检测到24 kD的CD9蛋白。进一步灰度分析的结果显示，MII期卵母细胞表达量比GV期高；早期胚胎中，2-细胞胚表达量最多，其次是8-细胞期胚，4-细胞胚的表达量最少。
　　3.CD9蛋白在绵羊卵巢和附睾组织中的表达
　　CD9蛋白的免疫荧光检测结果发现，在绵羊卵巢中，各发育阶段卵泡的颗粒细胞中有表达，并随着卵泡直径的增大，其表达强度有逐渐增强的趋势，在卵泡膜上有弱表达。在绵羊附睾中，头、体部管壁上有表达，且体部绿色荧光信号最强，尾部管壁上呈弱阳性。CD9蛋白的免疫印迹结果显示，卵巢和附睾头体部中均检测到24 kD的CD9蛋白。其灰度分析的结果与免疫组化结果一致。
　　4.CD9特异性抗体对精卵结合和融合的影响
　　卵母细胞与CD9单克隆抗体共同孵育后进行体外受精实验结果显示，实验组（4.4±0.1/卵母细胞，穿卵率41.5％）明显低于对照组（6.0±0.3/卵母细胞，穿卵率81.4%），差异显著（P<0.01），并且呈剂量依赖性。

目录

缩 略 词 表

1 引言

1.1四跨膜家族(Tetraspanins)

1.2 四跨膜蛋白CD9家族成员与受精关系

1.3 四跨膜蛋白CD9研究现状和结构

1.4 四跨膜蛋白CD9 作为精子受体

1.5四跨膜蛋白CD9与免疫

1.6四跨膜蛋白CD9与疾病

1.7 本研究内容、研究目标以及提出的问题

1.8 研究技术路线

1.9 研究方案

1.10项目的特色与创新之处

2 实验一 CD9在绵羊卵母细胞和早期胚胎中RNA水平上的表达

前言

2.1 材料与仪器

2.2 方法

2.3 结果

3 实验二 CD9在绵羊卵母细胞、早期胚胎、卵巢及附睾中蛋白质水平上的表达

前言

3.1 材料与仪器

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 实验三 CD9单克隆抗体对绵羊精卵结合和融合的影响

前言

4.1 材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

结 论

致谢

参考文献

作 者 简 介