基于三种底物筛选纤维素降解微生物和构建降解复合系及其滤纸降解能力分析

摘要

全球能源危机和环境污染日趋严重，可再生物质能源的开发和利用将成为解决这些危机的主要途径。纤维素资源是地球上最丰富的可再生能源。目前，纤维素降解菌是利用纤维素的基础，分离培养高效降解菌是主要的手段。以往研究主要针对单一的底物分离纤维素降解菌，获得的菌株普遍存在酶活较低、酶的适应性不强等缺陷。针对地区气候、基于多种底物进行分离培养，并且以酶活较高的菌株构建复合系，有望获得适应地区气候的、纤维素降解效率较高的菌株或复合系。
　　根据内蒙古东北部地区气温较低及其季节持续时间较长的特点，本研究分别以三种不同纤维素（微晶纤维素、CMC和D-水杨苷）作碳源对呼伦贝尔森林土壤中的常温和低温纤维素降解细菌分别进行筛选并测定菌株酶活，将常温和低温条件下活性高的菌株分别混合构建了相应温度的复合系、并测定其滤纸降解能力。本研究的结果和结论如下所示：
　　（1）常温（培养温度25℃）降解菌株：在常温条件下，分离筛选共得到细菌258株。在纲的水平上，降解微晶纤维素的细菌分属于5个纲，变形菌门中的γ–Proteobacteria占常温全部细菌的38％，为优势菌纲，其次为α–Proteobacteria（26%）和放线菌门（ Actinobacteria）中的 Micrococcales纲（17%），在属的水平上， Pseudomonas属约占23%，为优势菌属，其次为Rhizobium属（12%）、Lelliottia属（12%）、Oerskovia属（12%）和Bacillus属（12%）；分解CMC的细菌分属于6个纲，γ–Proteobacteria（34%）为优势菌纲，其次为α–Proteobacteria（21%）和Micrococcales（19%），属水平上，Pseudomonas属（23%）为降解CMC的优势属；利用D-水杨苷的细菌均分别分属于6个纲，γ–Proteobacteria（38%）为优势菌纲，其次为α–Proteobacteria（23%）和Micrococcales（20%），在属水平上，Pseudomonas（26%）为优势菌属，其次为Oerskovia属（20%）。
　　（2）低温（培养条件4℃）降解菌株：在低温条件下，分离筛选得到细菌172株。分解微晶纤维素、CMC的细菌分别均分属于相同的4个纲，优势菌纲均为γ–Proteobacteria，比例分别为54%和48%，其次为α–Proteobacteria，比例分别为28%和26%，在属的水平上，降解微晶纤维素的优势菌属为Pseudomonas属（35%），其次为Rhizobium属（15%），降解CMC的优势菌株为Pseudomonas属（26%），其次为Rhizobium属（12%）和Oerskovia属（12%）；利用D-水杨苷的细菌均分别分属于6个纲，γ–Proteobacteria（55%）为优势菌纲，其次为α–Proteobacteria（34%），属水平分类上，Pseudomonas属（26%）为降解D-水杨苷的优势菌属，其次为Lelliottia属（19%）和Rhizobium属（16%）。
　　不管从温度条件还是从利用碳源角度，γ-Proteobacteria都是第一优势菌纲，α-Proteobacteria为第二优势菌纲，说明Proteobacteria群落在降解纤维素细菌中占绝对的数量优势；其次Actinobacteria在纤维素降解细菌中也占一定的比例。
　　（3）常温（培养温度25℃）降解复合系：选择3种碳源中各自底物酶活最高的3株菌（降解微晶纤维素的菌株为DCXA52、DCXA22和DCXA58，降解CMC的菌株为DCXC50、DCXC10和DCXC16，降解D–水杨苷的菌株为DCXD27、DCXD7-1和DCXD68），构建成27个降解复合系。降解复合系滤纸酶活性最高可达208.79U/mL，分别约为该复合系成员菌株DCXA58、DCXC50、DCXD27滤纸酶活的8.0倍、9.8倍和9.2倍；该复合系的7天滤纸降解率为32.4%。
　　（4）低温（培养温度4℃）降解复合系：选择3种碳源中各自底物酶活最高的3株菌（降解微晶纤维素的菌株为4DXA13、4DXA23和4DXA41，降解CMC的菌株为4DXC19、4DXC32和4DXC64，降解D–水杨苷的菌株为4DXD98、4DXD101和4DXD114），构建成27个降解复合系。滤纸酶活性最高的降解复合系为7（D131）和8（D132），酶活性可达158.02U/mL，前者的滤纸酶活性约为其复合系成员菌株4DXA13、4DXC64、4DXD98的9倍、5倍、9倍，后者约为其复合系成员菌株4DXA13、4DXC64、4DXD101的9倍、5倍、10倍。复合系7（D131）和8（D132）的7天滤纸降解率分别为16.8%和18.8%。
　　本研究共获得纤维素降解菌株430株，来自于5个门6个纲21个属，其中，常温和低温菌株酶活性最高分别为82.97U/mL和19.1U/mL，构建的常温和低温降解复合系滤纸酶活最高酶活分别为208.79U/mL和158.02U/mL。这些结果表明呼伦贝尔森林土壤中纤维素降解微生物种类多样性高、降解能力强，具有较高的应用潜力。本文的研究为呼伦贝尔森林土壤中纤维素降解微生物多样性的充分认识和利用提供了基础依据。

目录

声明

1 引言

1.1 纤维素概述

1.2 纤维素酶简介

1.3 降解复合系降解纤维素

1.4 研究目的、内容和意义

2 实验材料

2.1 试验样品

2.2 主要实验药品

2.4 实验试剂

2.5 培养基配方

2.6 引物

3 实验方法

3.1 常温纤维素降解细菌分离、筛选及鉴定

3.2 低温纤维素降解细菌分离、筛选及鉴定

3.3 纤维素酶活的测定

3.4 常温细菌降解复合系构建及其降解滤纸研究

3.5 低温细菌降解复合系构建及其降解滤纸研究

4 结果与分析

4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

4.2 常温纤维素降解细菌的分离纯化、鉴定和酶活测定

4.3 常温细菌降解复合系的构建及其降解滤纸研究

4.4 低温纤维素降解细菌的分离纯化、鉴定和酶活性测定

4.5 低温纤维素降解降解复合系的构建及其降解滤纸研究

5 讨论与结论

5.1 讨论

5.2 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介