无选择标记和无载体骨架序列的转反义ACS1基因河套蜜瓜耐贮藏品系选育

摘要

甜瓜属于葫芦科甜瓜属，是一年生蔓性革本植物，甜瓜果实营养丰富、甘甜可口、风味独特，深受人们喜爱，被列为世界十大水果之一。我国是甜瓜生产第一大国，约占世界总面积和总产量的一半。本研究选用内蒙古河套地区特产的地方优良甜瓜品种河套蜜瓜。河套蜜瓜是典型的呼吸跃变型果实，果实采后快速出现呼吸高峰，果实迅速软化腐烂。提高果实耐贮性是河套蜜瓜育种重要目标之一。本实验以植物双元表达载体pPZP221为构建的最初载体，用Mssl和Vspl双酶切pPZP221，去掉T-DNA上的庆大霉素抗性选择标记基因aacCl，并在该位点重新插入CaMV35S启动子和nos终止子序列。将甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶1(ACS1)基因cDNA编码区0.65kb核苷酸序列反向构建到上述载体的Xbal和Sacl位点。最后用Mssl和Vspl双酶切T-DNA左右边界两侧，获得了无植物选择标记基因和无载体骨架序列的反义ACS1基因的线性表达盒。电泳回收目的片段，回溶于0.1×SSC溶液(pH7.0)中，使中浓度达到10ng/μL。应用本实验室已建立的甜瓜花粉管通道法转基因技术将目的DNA片段导入受体材料甜瓜品种河套蜜瓜，经选育获得了T1代转基因耐贮藏品系。主要研究内容及结果如下：
　　 ⑴导入了30朵花，收获24颗果实，从每颗果实中随机选取10粒种子播种后经PCR检测，有6颗果实的T0种子阳性率较高。
　　 ⑵将从上述阳性率较高的六颗果实中各随机选取30粒T0种子，播种于大田，当果实成熟时在田间筛选出5个耐贮藏植株。
　　 ⑶从耐贮性好的5颗T0果实中各随机筛选出30粒种子，种植在育苗盘内，经PCR检测，将阳性苗移栽到冬季日光温室，获得耐贮藏的T1株系。
　　 ⑷转基因T0、T1果实在常温下可贮藏40天。此时，可溶性固形物含量与未转基因对照果实常温贮藏10天时的基本相同，而未转基因对照果实采后20天时已软化腐烂，无法进行测量。
　　 ⑸未转基因对照果实在贮藏10天时，硬度约3.1kg/cm2，且硬度逐渐下降，而转ACC合成酶基因反义片段的T0、T1果实贮藏40天时，果实硬度基本保持4.6 kg/ cm2左右。
　　 ⑹采后贮藏40天时转基因T0、T1果实的内源乙烯浓度均明显低于未转基因对照果实，约为对照果实的3%-5%。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

材料和方法

1 材料

1.1 菌种与质粒

1.2 试剂

1.3 引物

2 方法

2.1 植物表达载体pPZP221中植物选择标记的去除

2.2 无选择标记、无载体骨架的反义ACS1基因表达盒的获得

2.3 花粉管通道法转化

2.4 转化种子和植株的检测

2.5 耐贮藏品系的选育

2.6 生理生化分析

结果与分析

3.1 植物表达载体pPZP221中植物选择标记的去除

3.2 无选择标记、无载体骨架的ACS1基因反义片段的获得

3.2.1 重组质粒的筛选

3.2.2 植物表达载体pPZP—ACS中含有左右边界的表达盒的酶切及回收

3.3 T0代植株的检测

3.4 T0代果实筛选及生理生化分析

3.5 T1代果实筛选及生理生化分析

讨论

参考文献

文献综述

致谢