狂犬病毒胶体金试纸条的制备和杂交瘤细胞株的免疫加强

摘要

狂犬病是一种常见的人兽共患病,是由于狂犬病毒感染造成的。狂犬病具有很强的潜伏性,很多携带狂犬病毒的动物并不表现出患病症状,这对狂犬病的及早发现和预防造成了非常大的困难。本实验旨在制备方便快捷并且具有高效性特异性的狂犬病毒胶体金免疫检测试纸条,使检测狂犬病的潜在病源更加方便,从而使狂犬病从传染源上得到更好的控制。本论文的前半部分就对胶体金试纸条的研制进行了初步的研究和探索。
　　 在制备单克隆抗体杂交瘤时,常常因为培养条件的改变、传代次数的增加以及冻存和解冻等对杂交瘤造成一定的影响,使杂交瘤分泌抗体的能力减弱甚至消失,而只能重新制备杂交瘤或者选取其他的杂交瘤,这就对实验周期和实验的一致性造成了影响。而通过体外致敏淋巴细胞可以快速获得能够分泌抗体的免疫细胞,如果能够将不能分泌抗体的杂交瘤通过体外免疫手段重新刺激,使其能够重新获得或者提高分泌抗体的能力,那么将大大缩短实验周期、提高实验的效率,本论文的后半部分就对杂交瘤进行体外致敏的方法进行了初步的研究。
　　 一单杂交瘤的选择和抗体纯化
　　 本试验首先通过有限稀释ELISA和夹心ELISA法分别测定了7株本实验室制备的单克隆抗体杂交瘤所产生的单抗的相对亲和力和识别抗原表位,并发现杂交瘤17E3所分泌的单克隆抗体有最强的结合力,而杂交瘤17F3与1782、17E3以及17E4识别的抗原表位最远,17E3与1782、17E4所识别的抗原表位最近。然后选择17E3、17B2和17F3三株杂交瘤,对石蜡油处理的Balb/c小鼠进行腹腔注射,制备了具有免疫效价的腹水,并经过辛酸.硫酸铵法对腹水进行了IgG亚型抗体的纯化,分别得到了浓度为1.88mg/mL的17E3单克隆抗体和浓度为1.51mg/mL的混合抗体(17B2和17F3);经SDS-PAGE检测发现,在50kD和25KD处有明显的条带出现,说明纯化得到的蛋白是IgG型抗体,并且具有较高的纯度,能够满足进一步试验的要求。
　　 二胶体金的制备
　　 采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒大小为20-30nm的胶体金。制备得到的胶体金呈现酒红色,并且在4℃和室温下存放一个月都未发生凝集沉淀现象,说明胶体金的金颗粒大小符合要求,在20-30nm之间,并且具有良好的稳定性。
　　 三胶体金包被抗体
　　 将制备的单克隆抗体用胶体金包被,用于胶体金试纸条结合垫的制备。首先需要确定稳定胶体金的最小蛋白浓度。通过实验得出每200μL的胶体金加入4μL的4倍稀释纯化17E3单克隆抗体IgG,能使其在添加40μL10％的NaCl作用下保持稳定,不发生凝集,所以在包被胶体金的时候应选择最小稳定量的120％,即每毫升24μL的4倍稀释17E3单克隆抗体。
　　 胶体金标记抗体的稳定性检测发现,在4℃保存1周以上的金标抗体未发生凝聚,说明制备的金标抗体稳定性良好。
　　 四金标抗体试纸条的制作
　　 金标抗体试纸条包括滴加样品的样品垫、样品与金标抗体发生抗原抗体反应的结合垫、用于检测样品是否带有抗原的检测垫以及吸水垫四部分构成。实验中首先对制作样品垫、结合垫以及检测垫的材料进行了筛选,Ahlstrom8964玻璃纤维板对金标抗体的干燥最适合,能够结合大量的胶体金,而且凝固后颜色较为均匀,可以保证在层析时金颗粒在硝酸纤维素膜上均匀扩散。对于检测垫,选择层析速度适中的Millipore135、Immunopore FP或者Prima40。
　　 其次,经过筛选发现,以pH9.0含0.2％ Tween-20 Tris-HCl缓冲液包被样品垫是最理想的,将胶体金以1∶2比例稀释后包被结合垫能够产生可见的沉淀线和较轻的背景色。混合抗体包被检测线可以在阳性测试中显示出沉淀线,而在阴性测试中不产生沉淀线,但是质控线无论在阳性测试还是阴性测试中都不会产生沉淀,这可能是由于包被质控线所使用的羊抗鼠IgG的浓度不足或者效价不高造成的。
　　 五杂交瘤的体外致敏
　　 试验选取分泌单克隆抗体能力减弱的杂交瘤作为实验对象,通过添加胸腺细胞条件培养液,使杂交瘤、杂交瘤+脾细胞、脾细胞分别与不同梯度的狂犬病疫苗抗原作用4天,用ELISA方法对产生细胞培养上清液进行检测,观察是否出现抗体分泌的增加。结果显示无论是杂交瘤单独与抗原作用,还是杂交瘤+脾细胞与抗原作用,还是脾细胞与抗原相作用,都不能获得有效的抗体增加。这可能是因为:1杂交瘤不具有被再次致敏的潜质;2试验中的体外致敏体系不具备使杂交瘤获得免疫的条件。这些还需要进一步的实验来确定。