抗人DR4多克隆抗体的制备及其诱导HeLa细胞凋亡的研究

摘要

诱导肿瘤细胞凋亡是多种癌症治疗方法之一。在癌症治疗中肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的死亡受体已经成为最具有潜力的治疗靶位点之一。DR4(Death receptor4)是TNFR超家族成员之一,其分子中具有富含半胱氨酸的胞外结构域和胞内死亡结构域(death domain,DD)。DR4的膜外区与其配体TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)特异性结合后可激活效应分子天冬蛋白酶(caspase),引发凋亡信号途径,最终导致肿瘤细胞凋亡。抗人DR4单克隆抗体能够有效杀死肿瘤细胞,并对正常细胞无细胞毒作用,因而成为抗肿瘤抗体药物研究和开发的热点。但是单抗制备繁琐且成本高,在临床上尚难广泛应用。而多克隆抗体制备简单且价格便宜。因此我们制备了抗人DR4多克隆抗体,初步研究了人DR4多抗诱导HeLa细胞凋亡的效果。
　　 本文采用RT-PCR方法从HeLa细胞中成功克隆出人DR4胞外区域(eDR4),通过抗原表位分析选择胞外区域抗原特异性较高的部分序列,构建重组克隆载体pMD-eDR4,测序鉴定正确后构建原核重组表达载体pGEX-DR4并经IPTG诱导在大肠杆菌中获得表达。经Western blot鉴定,证实pGEX-DR4所表达的是融合蛋白GST-DR4。然后采用亲和层析法分离纯化融合蛋白GST-DR4,再通过切胶、透析获得高纯度的融合蛋白GST-DR4。用GST-DR4作为免疫原免疫小鼠制备了抗人DR4多克隆抗体。经过Western blot、ELISA方法鉴定获得了高特异性、效价达1:12800的抗人DR4多克隆抗体。用制备好的抗人DR4多克隆抗体分别处理HeLa细胞和人主动脉平滑肌细胞(HASMC),发现HeLa细胞在形态上有明显的变化,细胞皱缩趋于圆形,核碎裂,形成凋亡小体；而HASMC的形态无变化。MTT法检测结果显示DR4抗体处理后HeLa细胞的生长受到明显抑制,并且随着浓度的降低抑制率逐渐减小,将DR4抗体和DR5抗体同时处理细胞,发现二者具有协同作用,对细胞生长的抑制能力要强于同等浓度下分别作用细胞的DR4和DR5抗体。进一步用TUNEL法、Caspase3的Western blot检测证实HeLa细胞发生了凋亡。本实验为研发DR4多克隆抗体作为抗癌药物奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 人DR4胞外区域cDNA的克隆

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 HeLa细胞总RNA的提取

2.2 人DR4 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.3 人DR4 cDNA重组克隆载体的鉴定及测序结果与分析

2.4 抗原表位分析结果

3 讨论

第二章 GST-DR4融合蛋白的表达、分离与纯化

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 pGEX-DR4重组载体质粒的酶切及PCR鉴定

2.2 人DR4在大肠杆菌中的表达及纯化

2.3 GST-DR4融合蛋白的Western blot鉴定

2.4 纯化后的GST-DR4融合蛋白浓度的测定

3 讨论

第三章 抗人DR4腹水多克隆抗体的制备与鉴定

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 抗GST-DR4多克隆抗体的鉴定

2.2 抗GST-DR4多克隆抗体的效价检测

3 讨论

第四章 抗人DR4多克隆抗体诱导HeLa细胞凋亡的观察

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 抗人DR4多克隆抗体处理后细胞形态的改变

2.2 MTT法生长抑制检测

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡结果

2.4 Caspase 3的Western blot结果

3 讨论

参考文献

文献综述

1.Apo2L/TRAIL与它的死亡受体和诱捕受体

2.Apo2L/TRAIL诱导凋亡机理

3.抗Apo2L/TRAIL死亡受体抗体在肿瘤治疗中的研究进展

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的学术论文