小鼠胚胎干细胞系的建立与体外诱导向生殖细胞分化研究

摘要

小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcells）是由囊胚内细胞团在体外培养条件下建立的多能性干细胞系，具有形成嵌合体的能力，并能发育为嵌合体的任何组织、细胞类型，包括生殖细胞。胚胎干细胞在体外也能自发分化形成三个胚层的细胞;在特定诱导条件下，能分化成肌肉、神经、胰岛等细胞类型。特别地，胚胎干细胞在一定条件的诱导下，可以体外向生殖细胞分化。
　　生殖系的发育是大多数物种全能性（受精卵）和子代产生的源头。在小鼠中，生殖系发育起始于原生殖细胞(primodialgermcells)在胚胎发育第7天的出现;而这一过程受到了精密的细胞信号调控，特别是BMP4/Smads和SCF/c-Kit信号通路，前者对于原生殖细胞发育、后者对于原生殖细胞生长是必须的。无论雌雄，原生殖细胞都是最终的生殖细胞——卵母细胞和精子——的来源。在雄性小鼠，原生殖细胞在特化后迁移到发育中的雄性生殖脊，最终形成精原干细胞(spermatogonialstemcells)，通过减数分裂维持整个雄性小鼠成年后的生精过程。
　　本研究拟利用细胞因子诱导小鼠胚胎干细胞在体外条件下向生殖脊分化。首先，C57BL/6J雌鼠与Oct4-EGFP转基因雄鼠（ES-4N）交配后，分离其囊胚，建立胚胎干细胞系。不同的培养条件下，小鼠胚胎干细胞建系的效率明显不同，在2i-LIF培养基中效率最高，且干细胞维持基态(groundstate)。
　　为了使得胚胎干细胞在最终分化为精子后便于分离、观察、鉴定，对小鼠胚胎干细胞进行了精子特异性荧光标记的转基因实验。利用基因工程技术构建了pAcr-DsRed重组载体。载体启动子为顶体素基因(Acr)的启动子，其在减数分裂以后的精子细胞中开始表达，因此可以用来特异性标记精子。将重组载体电转染胚胎干细胞，经G418筛选出阳性克隆后，制备嵌合体小鼠。
　　利用细胞因子对小鼠胚胎干细胞进行诱导分化。首先利用bFGF和ActivinA诱导胚胎干细胞向表胚层细胞(epiblast)分化;再用BMP4和SCF诱导其向生殖细胞分化。实验结果显示，在BMP4和SCF的作用下，胚胎干细胞向生殖系分化，相关特异性蛋白在诱导后的转录水平明显上升。BMP4单独作用也可得到类似的结果，而SCF单独作用不能诱导胚胎干细胞向生殖系分化。这与生殖系在体内发育时的信号调控通路是一致的。
　　综上所述，小鼠胚胎干细胞在体外建系时，2i-LIF培养体系是最为高效的;在转染了精子特异性标记后，胚胎干细胞仍具有全能性，这为研究胚胎干细胞向生殖系发育提供了很好的实验基础。体外诱导分化实验表明，BMP4/Smads信号通路对于胚胎干细胞向生殖系分化是必须的，它可以使得被诱导细胞开始转录生殖系相关的基因。而SCF/c-Kit信号通路则不是必须的。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

第一章 干细胞定向诱导分化精子研究进展

1．1 胚胎干细胞向生殖系分化

1．2 原生殖细胞分化成精子

1．3 精原干细胞分化成精子

1．4 诱导多能干细胞分化为精子

1．5 展望

第二章 小鼠胚胎干细胞的分离、培养、鉴定

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 转Acr-DsRed基因小鼠胚胎干细胞的制备及鉴定

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 小鼠胚胎干细胞体外诱导向生殖细胞分化

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

参考文献

附录

攻读硕士期间发表论文

致谢