Cyclopmine对牛脂肪间充质干细胞的细胞周期及成骨与成脂分化的影响

摘要

间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力，能在体外诱导成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肌细胞等，所以越来越多的研究集中在其增殖与分化机制方面。希望将其作为种子细胞，能够在临床坏死损伤组织器官的修复治疗中起到一定作用。而脂肪间充质干细胞(adiposemesenchymalstemcells，AMSCs)取材方便，来源较为丰富。
　　本试验利用hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine(CPA)，对牛AMSCs的细胞分裂周期及成骨与成脂诱导分化的机制做了初步探讨。我们首先获得牛AMSCs，然后用CPA处理AMSCs，用real-timePCR方法检测不同时期周期蛋白cyclinA、cyclinD、cyclinE、及定向分化过程中关键基因的表达。主要研究成果如下:(1)采用胶原酶Ⅳ法消化分离，体外培养观察其形态，用免疫荧光化学的方法鉴定其表面标记抗原，加入成脂成骨诱导液诱导其分化，用油红O和ALP检测其分化能力。结果证实，分离培养出的细胞是脂肪间充质干细胞。检测表明，CD44、CD49、CD105表达呈阳性;CD34表达呈阴性;用油红O和ALP染色后都呈阳性。(2)用5μM的CPA处理细胞后，所检测的周期蛋白的表达均受到不同程度的抑制。经CPA处理培养12h后，处理组细胞的cyclinA表达量就显著低于对照组(P＜0.05);而cyclinD的表达从处理之初就极显著低于对照组(P＜0.01)。CyclinE的表达从8h起与对照组出现显著差异(P＜0.05)，到12h时，差异极为显著(P＜0.01)。(3)在成脂分化过程中，诱导液中加入5μM的CPA，在诱导处理10天后，处理组与对照组均形成脂肪细胞，在形态上无明显区别。但在诱导4天后，CPA处理组细胞的PPARγ的表达量显著高于对照组(P＜0.01)。(4)当在成骨诱导培养液中加入5μM的CPA时，对照组与处理组在成骨形态上无明显差异。但在成骨分化过程中，处理组中与成骨作用关键基因Runx的表达，从开始一直平行显著低于对照组(P＜0.01)。
　　试验结果表明，CPA处理显著影响了牛AMSCs的细胞周期蛋白基因的表达;在AMSCs的成脂化与成骨化过程中，虽然CPA对成脂化与成骨化细胞的形态上没有影响，但是CPA显著促进了成脂关键基因的表达而抑制了成骨关键基因的表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

一、试验研究

前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 形态学观察

2．2 生长曲线

2．3 成脂诱导

2．4 成骨诱导

2．5 荧光免疫组化鉴定AMSCs表面标记

2．6 CPA处理同步化AMSCs对细胞周期进程的影响

2．7 CPA处理对AMSCs凋亡的影响

2．8 CPA处理对周期蛋白cyclinA、cyclinD、cyclinE表达的影响

2．9 CPA对AMSCs成脂分化关键基因PPARγ的影响

2．10 CPA对AMSCs成骨分化关键基因Runx的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

二、文献综述

1 Hh信号通路的转导过程

1．1 Hedgehog蛋白的合成

1．2 Hedgehog蛋白的转运

1．3 转录因子的激活

2 Hh信号通路的作用

2．1 对胚胎发育的影响

2．2 Hedgehog蛋白促进MSCs的增殖

2．3 Hedgehog蛋白促进MSCs的分化

3 Cyclopamine研究

3．1 cyclopamine的来源与发现

3．2 Cyclopamine对hedgehog信号通路的作用

参考文献

攻读硕士期间发表及待发表的论文

致谢