长叶红砂胚胎晚期富集蛋白RtLEA基因的克隆及功能分析

摘要

长叶红砂（Reaumuria trigyna），隶属柽柳科(Tamaricaceae)琵琶柴属(Reaumuria Linn.)，是亚洲中部区东阿拉善-西鄂尔多斯特有种，属我国特有，被列为内蒙古自治区珍稀濒危植物。该植物对盐渍环境具有极强适应性，能够在高盐环境下完成其生活史。胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant protein，LEA)是植物胚胎发育后期在胚胎中大量表达的一类蛋白。它广泛的存在于植物体中，表达量受发育阶段、脱水信号和脱落酸(ABA)的调节。在植物抵御高盐、干旱等逆境时发挥着重要的作用。
　　本实验运用RT-PCR和RACE技术克隆了编码长叶红砂LEA蛋白基因(RtLEA)的全长cDNA序列，该基因全长765bp，包含一个315bp的开放阅读框，编码一个由104个氨基酸组成的蛋白，预测分子量为11.282kDa，等电点为7.92。长叶红砂RtLEA蛋白拥有第五组LEA家族蛋白的特有序列W(A/V)PDP(V/I)TGYYRP。该蛋白含有LEA蛋白的保守结构域pfam LEA-3，根据Battaglia的LEA蛋白分类标准，属于Group5B。系统进化分析显示长叶红砂RtLEA蛋白与柽柳（柽柳科，柽柳属）LEA蛋白的亲缘关系最近。
　　半定量RT-PCR分析结果表明， RtLEA基因的表达受盐、干旱、低温、ABA的诱导。利用Sitefinding PCR克隆了该基因的启动子区，序列分析结果显示RtLEA基因5'上游调控区含有响应盐、干旱、低温、ABA等非生物胁迫的顺式作用元件，并且有两个胚乳特异表达元件。
　　为了研究RtLEA基因的异源表达特性，构建了RtLEA基因的原核表达载体PET-32a-RtLEA。对大肠杆菌表达菌株Rosetta进行转化与诱导表达，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到了与预期大小一致的融合蛋白。RtLEA蛋白提高了重组菌对高盐、渗透、高温、低温、ABA等非生物胁迫的耐受性。初步证明长叶红砂RtLEA蛋白具有多重抗逆功能。
　　克隆了RtST基因的eDNA全长，该基因全长2232bp，包含一个1962bp的开放阅读框，编码一个653个氨基酸的蛋白质，预测分子量为71.18kDa，等电点为9.25。序列分析显示，RtST蛋白含有硫转运蛋白家族的典型特征，即12个跨膜结构域，C末端和N末端都向着膜内侧，C末端有STAS区。序列中部有硫酸盐结构域。系统进化分析表明，RtST与拟南芥第三亚组的硫转运蛋白的亲缘关系最为接近。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 国内外研究进展

1．1．1 植物LEA蛋白研究进展

1．1．2 硫转运蛋白研究进展

1．1．3 长叶红砂耐盐性研究进展

1．2 研究意义及技术路线

1．2．1 研究意义

1．2．2 技术路线

第二章 长叶红砂RtLEA基因的克隆与序列分析

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 长叶红砂RtLEA基因片段的克隆

2．1．4 长叶红砂RtLEA基因全长cDNA的克隆

2．1．5 长叶红砂RtLEA基因全长的生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 长叶红砂RtLEA cDNA片段扩增

2．2．2 长叶红砂RtLEA cDNA全长克隆

2．2．3 长叶红砂RtLEA生物信息学分析

2．3 讨论

第三章 长叶红砂RtLEA基因表达分析

3．1 实验材料和方法

3．1．1 长叶红砂RtLEA基因的表达特性分析

3．1．2 长叶红砂RtLEA基因启动子的克隆和分析

3．2 结果与分析

3．2．1 长叶红砂RtLEA基因的表达特性分析

3．2．2 长叶红砂RtLEA基因启动子的克隆和分析

3．3 讨论

第四章 长叶红砂RtLEA基因的原核表达

4．1 实验材料

4．1．1 菌种和质粒

4．1．2 主要试剂及配制

4．2 实验方法

4．2．1 长叶红砂RtLEA基因的原核表达载体构建

4．2．2 重组质粒PET-32a-RtLEA转化表达菌E．coli ROSETTA及PET-32a-RtLEA的诱导表达

4．2．3 重组菌的抗逆性检测

4．3 实验结果和分析

4．3．1 长叶红砂RtLEA基因的原核表达载体构建

4．3．2 PET-32a-RtLEA蛋白的诱导表达

4．3．3 重组菌的抗逆性检测

4．4 讨论

第五章 长叶红砂RtST基因的克隆与序列分析

5．1 材料和方法

5．1．1 植物材料的培养与胁迫处理

5．1．2 实验方法

5．2．结果与分析

5．2．1 长叶红砂RtST基因全长cDNA的克隆

5．2．2 长叶红砂RtST的生物信息学分析

5．3．讨论

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢