人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

摘要

本研究将人工合成的纳豆激酶基因sNK和在其中插入番茄E8基因第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i转化到模式植物烟草中，以期提高纳豆激酶在烟叶中的表达水平。通过正交试验得到在烟草NC89叶片中瞬时表达纳豆激酶基因的最优条件，进而在瞬时表达系统中对人工合成的sNK基因和含E8内含子的sNK-E8i基因进行mRNA水平上表达量的检测。由RT-qPCR结果可知，我们人工合成的两个纳豆激酶基因均在mRNA水平上有表达。
　　通过农杆菌侵染的方法将两种基因稳定转化到烟草NC89中。经PCR检测，得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株，初步证明目的基因已整合到烟草基因组中。RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性。通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较，结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因植株高。通过纤维蛋白平板法检测其活性，共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈，说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。

目录

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摘要

缩写词说明

第一章 引言

1．1 研究背景

1．1．1 纳豆与纳豆激酶

1．1．2 植物生物反应器

1．2 本研究的立题依据和意义

第二章 农杆菌介导的sNK、sNK-E8i基因瞬时表达系统的建立

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 植物表达载体的农杆菌转化

2．2．2 烟草转纳豆激酶基因瞬时表达系统的建立

2．3 结果与分析

2．3．1 植物表达载体转化农杆菌

2．3．2 瞬时表达系统的建立

2．3．3 含与不含内含子纳豆激酶基因瞬时表达情况比较

第三章 农杆菌介导法转化烟草

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 无菌苗的培养

3．2．2 农杆菌的活化及扩培

3．2．3 农杆菌侵染烟草叶盘外植体

3．2．4 转基因烟草基因组DNA的提取(SDS法)

3．2．5 转基因再生植株的PCR鉴定

3．2．6 烟草总RNA的提取

3．2．7 反转录

3．2．8 RT-PCR

3．2．9 RT-qPCR

3．2．10 烟草总蛋白的提取

3．2．11 纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性

3．2．1 2 NC89庆大霉素本底抗性水平测定实验

3．2．13 T1代转基因烟草的筛选及鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 转基因烟草植株的获得

3．3．2 RT-PCR检测

3．3．3 RT-qPCR

3．3．4 转基因烟草植株纳豆激酶酶活检测

3．3．5 转纳豆激酶烟草植株的加代培养

第四章 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

参考文献

致谢

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