拟南芥AtGLR3.3在谷胱甘肽诱导下参与植物先天免疫反应的分子机理研究

摘要

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸(Glu)，半胱氨酸(Cys)，甘氨酸(Gly)组成的三肽，是植物和动物细胞中主要的内源性抗氧化物。同时在动物中枢神经系统中，GSH也是一种神经递质。它通过与膜上的离子型谷氨酸受体(iGLRs)结合来介导各神经元之间的交流。但是，在植物细胞中，关于GSH作为信号分子引起的信号通路知之甚少。本研究发现，当外源GSH处理野生型拟南芥(Col-0)叶片时，胞内Ca2+浓度会瞬时升高。同样处理突变体atglr3.3则无Ca+信号升高现象。Col-0叶片在GSH处理前加入谷氨酸受体拮抗剂，胞内Ca2+浓度瞬时升高幅度会降低。因此GSH诱导拟南芥叶片细胞质内Ca2+瞬时升高依赖于AtGLR3.3。通过谷胱甘肽缺失型突变体(pad2)，atglr3.3和Col-0植株对细菌Pst DC3000的敏感性实验，我们发现，相对于Col-0，突变体pad2，atglr3.3更易感病。然后我们对标志性防御基因的表达量进行了定量分析。结果表明当病原菌侵染植株时，防御基因在Col-0叶片中的表达量显著升高，而在突变体atglr3.3中则无明显变化。因此，病原菌侵染拟南芥介导防御基因表达依赖于AtGLR3.3。以上实验表明细胞外GSH诱导的防御反应依赖于AtGLR3.3。目前已经证实AtGLR3.3的配体有谷胱甘肽(GSH)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，丙氨酸(Ala)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，丝氨酸(Ser)，我们用这八种化学药品处理突变体atglr3.3叶片，均无胞内Ca2+浓度瞬时升高现象，表明AtGLR3.3的配体依赖于AtGLR3.3诱导拟南芥叶片细胞质内Ca2+瞬时升高。但是只有GSH，Cys可以诱导野生型拟南芥发生先天免疫反应。细胞外GSH和Glu同时处理Col-0和突变体atglr3.3后，GSH依赖于AtGLR3.3表达的基因中有19个是防御型基因。而Glu依赖于AtGLR3.3所介导的防御型基因表达变化的只有4个基因。本研究表明，外源GSH介导的信号通路依赖于AtGLR3.3，尽管这些信号通路所引起的现象可能不会有因果联系。

目录

声明

摘要

符号说明

一 引言

1．1 谷胱甘肽的性质

1．2 谷胱甘肽在拟南芥中的作用

1．2．1 谷胱甘肽作为抗氧化剂

1．2．2 谷胱甘肽参与拟南芥生长发育

1．2．3 GSH的其他生理功能

1．3 水母发光蛋白(AEQ)发光原理

1．4 动物中谷氨酸受体

1．4．1 动物谷氮酸受体基因家族

1．4．2 动物中谷胱甘肽与谷氨酸受体的关系

1．5 拟南芥谷氨酸受体(AtGLRs)基因家族

1．5．1 AtGLRs家族的构成

1．5．2 AtGLRs的结构

1．5．3 AtGLRs家族参与植物生长发育的功能

1．5．4 AtGLRs家族参与植物的先天免疫反应

1．6 研究目的及意义

二 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种与质粒

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液与培养基的配制

2．1．5 引物

2．2 方法

2．2．1 拟南芥种植与生长

2．2．2 DNA的快速提取

2．2．3 atglr3．3-1和atglr3．3-2 T-DNA突变体的纯合鉴定

2．2．4 植物细胞质内钙离子浓度动态变化的测定

2．2．5 GSH和Glu处理拟南芥野生型和atglr3．3-2突变体芯片材料制备

2．2．6 表达谱芯片数据分析

2．2．7 RT-PCR

2．2．8 病原菌Pst DC3000侵染突变体的表型分析

三 结果与分析

3．1 外源GSH依赖于AtGLR3．3诱导[Ca2+]cyt瞬时升高

3．1．1 GSH诱导[Ca2+]cyt瞬时升高的浓度确定

3．1．2 不同化学物质处理拟南芥野生型叶片对其[Ca2+]cyt影响

3．1．3 GSH处理atglr3．3突变体叶片[Ca2+]cyt无变化

3．2 外源GSH依赖AtGLR3．3介导叶片基因早期转录应答

3．2．1 GSH依赖AtGLR3．3诱导基因表达的概括

3．2．2 GSH依赖AtGLR3．3介导植物防御基因和信号转导相关基因的表达

3．3 外源GSH依赖AtGLR3．3介导拟南芥先天免疫应答

3．3．1 病原菌Pst DC3000侵染野生型和突变体的表型分析

3．3．2 病原菌Pst DC3000诱导Col-0和atglr3．3突变体防御基因转录表达分析

3．4 AtGLR3．3特异性配体在先天免疫反应中的作用

3．5 AtGLR3．3特异性配体依赖AtGLR3．3诱导[Ca2+]cyt瞬时升高

3．6 Glu与GSH介导的植物基因早期转录应答截然不同

四 结论与讨论

4．1 讨论

4．1．1 钙库为拟南芥[Ca2+]cyt瞬时升高提供Ca2+

4．1．2 GSH依赖于AtGLR3．3介导植物先天免疫反应

4．1．3 GSH依赖于AtGLR3．3所介导植物基因早期转录应答

4．1．4 先天免疫反应与[Ca2+]cyt瞬时升高的关系

4．2 结论

参考文献

附表一

附表二

附表三

附图一

致谢