小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究

摘要

原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是哺乳动物生殖细胞的前体细胞，是在胚胎发育早期具有多能性和独特迁移活性的细胞，近年来已成为研究细胞命运决定、细胞迁移和表观遗传重编程调节机制的重要模型。但由于PGCs细胞数量有限、分离纯化难度大，这也使得相关研究还有待深化。本研究对小鼠PGCs细胞进行了初步的分离、鉴定和体外培养。
　　本研究选取10.5dpc和13.5dpc的小鼠胎儿，分别利用机械法和酶消化法获得分散的混合细胞，对细胞进行特异性SSEA-1抗体标记后，使用流式细胞仪分选PGCs，并对分选获得的细胞进行了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色和多能性标记分子OCT4免疫荧光染色鉴定，最后通过RT-PCR技术检测了PGCs特异性基因的表达。结果显示，分选所得细胞碱性磷酸酶阳性率为86.80％，免疫荧光染色表明所分选细胞呈SSEA-1和OCT4为阳性。RT-PCR技术检测结果显示分选细胞表达Prdm1、Lhcgr、Dppa3、Nr6a1等PGCs特异性标记基因，表明流式细胞分选获得的细胞主要为PGCs。
　　为建立PGCs细胞的培养方法，本研究采用胚胎生殖细胞(embryonic germcells，EG)培养液对经机械法和酶消化法获得的细胞进行初步培养并比较了不同饲养层（MEF和STO）和基底膜基质(Basement Membrane Matrix)的培养效果。结果表明，在以上三种培养体系中，13.5dpc胚胎来源的PGCs通过体外培养，均未形成集落。10.5dpc胚胎来源的PGCs培养结果显示，利用Matrix培养PGCs时更容易形成集落，其形态较大呈巢状，与周围细胞存在明显界限，且碱性磷酸酶染色呈阳性，免疫荧光检测也表明其表达多能性OCT4;而MEF和STO培养体系培养的PGCs，虽然都表达OCT4，但其形成的集落明显少于和小于Matrix上形成的集落，且界限不明显。证明Matrix在PGCs的体外培养中有助于其多能性的维持。
　　综上所述，本研究利用流式细胞分选技术获得了表达特异性标记分子的小鼠PGCs，利用Matrix进行细胞培养后可形成表达PGCs特异分子的集落，研究结果为进一步开展对PGCs的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述 PGCs发育过程中的分子调控

第一章 小鼠PGCs的分离和鉴定

引言

实验材料

实验方法

1．不同胚龄小鼠胚胎的获得以及处理

2．小鼠PGCs的分离

3．小鼠PGCs的鉴定

实验结果

1．不同胚龄小鼠胚胎的获得

2．小鼠PGCs的分离和分选

3．小鼠PGCs的AKP染色

4．小鼠PGCs的SSEA-1和OCT4染色鉴定

5．小鼠PGCs特异性标记基因的表达分析

讨论

第二章 小鼠PGCs的体外培养研究

引言

实验材料

实验方法

1．饲养层细胞和Matrix的准备

2．不同胚龄小鼠胚胎的获得及处理

3．原代小鼠PGCs的培养

4．细胞集落的鉴定

实验结果

1．小鼠PGCs的分离及初步鉴定

2．不同体外培养条件下小鼠PGCs集落形成的比较

3．不同体外培养条件下小鼠PGCs集落的AKP染色鉴定

4．不同体外培养条件下鼠PGCs集落的免疫荧光染色鉴定

讨论

结论

参考文献

致谢

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