左旋咪唑增强金黄色葡萄球菌凝集因子A亚单位疫苗免疫效果的研究

摘要

金黄色葡萄球菌是一种条件致病菌，能引起多种严重疾病。由于抗生素治疗金黄色葡萄球菌疾病产生严重的耐药性，开发金黄色葡萄球菌疫苗已迫在眉睫，其中亚单位蛋白疫苗在金黄色葡萄球菌疾病预防中居于重要地位。但由于蛋白疫苗在激活细胞免疫应答水平有限，目前，筛选合适的能增强细胞免疫应答的佐剂来加强亚单位蛋白疫苗的免疫效果是一种新型的免疫策略。左旋咪唑（Levamisole，LMS）是一种低分子量的化合物，且能够激发机体的细胞免疫应答。同时金黄色葡萄球菌凝集因子A(Clumping factorA，ClfA)是金黄色葡萄球菌重要的黏附因子，被认为是开发新型疫苗的理想候选抗原。本实验将左旋咪唑作为佐剂与金黄色葡萄球菌亚单位疫苗ClfA共同免疫小鼠，观察其是否能够增强金黄色葡萄球菌蛋白疫苗的免疫效果。
　　实验中首先对ClfA活性片段进行扩增，构建pGEX-4T-1-ClfA重组原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)内诱导表达，经SDS-PAGE与Western Blot对重组蛋白进行分析鉴定。重组蛋白经过纯化后，与LMS进行配伍免疫小鼠，ELISA法检测免疫后血清抗体IgG及其亚型IgG1和IgG2a的滴度;CFSE染色法检测T细胞增殖活性，流式细胞术检测CD4+-IFN-γ、CD4+-IL-17和CD8+-IFN-γ细胞分度，ELISA法检测小鼠脾细胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A细胞因子的分泌量。
　　实验结果显示，左旋咪唑作为佐剂与亚单位疫苗ClfA共同免疫小鼠后，LMS+ClfA组抗体效价最高、且与ClfA组相比差异显著(P＜0.05)，分析IgG抗体各亚型，发现ClfA组IgG抗体亚型主要以IgG1为主;LMS+ClfA组抗体形式以IgG2a为主;脾脏淋巴细胞上清细胞因子检测发现，LMS+ClfA组与ClfA组相比，细胞因子IFN-γ和IL-17A分泌量升高，差异显著(P＜0.05)。在胞内细胞因子染色实验中，LMS+ClfA组CD4+T细胞IFN-γ的表达量升高，与单独免疫ClfA组相比，二者差异显著(P＜0.05); LMS+ClfA组CD8+T细胞中IFN-γ的表达量相比ClfA组显著升高(P＜0.01)，LMS+ClfA组与ClfA组相比，CD4+T细胞表达IL-17的量也增高，组间差异显著(P＜0.05)。
　　结果表明，LMS不仅可以显著增强亚单位疫苗ClfA诱导的体液免疫反应，而且提高了机体Th1型细胞免疫应答水平，同时，一定程度上激发了机体Th17型细胞免疫应答。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 引言

1．1 金黄色葡萄球菌概述

1．2 金黄色葡萄球菌疫苗的研究进展

1．2．1 传统疫苗

1．2．2 基因工程疫苗

1．3 左旋咪唑佐剂研究概述

第二章 金黄色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)的克隆与原核表达

2．1 材料

2．1．1 菌种与载体

2．1．2 主要试剂

2．1．3 溶液配制

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 ClfA基因的克隆

2．2．2 克隆载体的构建

2．2．3 原核表达载体的构建

2．2．4 重组质粒的诱导表达

2．2．5 重组蛋白的分析、鉴定与纯化

2．3 实验结果

2．3．1 ClfA基因的扩增结果

2．3．2 克隆载体的双酶切结果

2．3．3 重组表达载体鉴定

2．3．4 ClfA序列分析

2．3．5 重组载体诱导表达

2．3．6 重组蛋白表达形式分析结果

2．3．7 重组蛋白Western Blot鉴定

2．3．8 重组蛋白纯化结果

2．4 讨论

第三章 LMS作为免疫佐剂增强蛋白疫苗ClfA免疫应答的研究

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 实验仪器

3．1．3 主要药品试剂及实验器材

3．1．4 主要溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 免疫原的制备

3．2．2 实验分组及免疫方法

3．2．3 间接ELISA法检测血清抗体水平

3．2．4 T淋巴细胞增殖实验

3．2．5 胞内流式分析法检测CD4+／CD8+T亚群细胞因子的表达

3．2．6 ELISA检测脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A

3．3 结果

3．3．1 血清IgG抗体及其亚型检测结果

3．3．2 T淋巴细胞增殖活性检测结果

3．3．3 胞内细胞因子表达量检测结果

3．3．4 脾细胞培养上清细胞因子检测结果

3．4 讨论

结论

致谢

参考文献