Fat-1转基因克隆渤海黑牛研究

摘要

Fat-1基因编码的产物是多不饱和脂肪酸脱氢酶，能将n-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)转化为n-3 PUFAs。本研究利用MAR（matrix attachment regions）序列作为启动元件，构建了MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR单顺反子表达盒，转染渤海黑牛胎儿成纤维细胞，通过有限稀释法挑取单克隆细胞进行培养，提取基因组DNA进行鉴定，获得了转基因阳性单克隆细胞系。然后，对转基因阳性细胞DNA整合，RNA、蛋白表达、脂肪酸含量等鉴定分析。用pMAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR载体（单酶切载体）和MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR载体（双酶切载体）分别制备转基因小鼠。将表达良好的转基因单克隆细胞通过体细胞核移植技术制备克隆胚胎。结果表明，(1)获得了稳定转染双酶切载体的单克隆阳性细胞系，该细胞系的n-3 PUFAs表达水平升高且n-6/n-3PUFAs的比值降低。脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表达与对照相比明显降低，脂肪酸代谢基因PPARA、PPARG降低。细胞中fatl蛋白表达。(2)获得了双酶切和单酶切载体的转基因小鼠。其中转基因双酶切鼠F0代7只，F1代3只，F2代2只;转基因单酶切鼠F0代7只，F1代28只。转基因双酶切鼠F0、F1和F2代鼠的肌肉和脂肪组织中n-3 PUFAs含量均升高，n-6/n-3PUFAs比值均降低;转基因单酶切鼠肌肉和脂肪组织中n-3 PUFAs含量降低，n-6/n-3 PUFAs比值升高。(3)双酶切鼠肌肉组织中脂肪酸相关基因实时定量分析，发现脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表达与对照相比明显降低，脂肪酸代谢基因PPARA、PPARG表达降低。(4)蛋白差异表达和动态定量分析，发现单酶切组试验差异蛋白有99个，其中上调蛋白62个，下调蛋白37个;双酶切组试验差异蛋白有118个，其中上调蛋白81个，下调蛋白37个。(5)利用表达良好的转基因细胞系为核供体生产24枚克隆胚胎，移植受体母畜12头，有2头妊娠。其中1头发育到期并生下健康犊牛。
　　上述结果表明，MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR载体的转基因细胞、转基因小鼠均有良好表达，而且可以生产转基因克隆牛。

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论文说明

摘要

缩略词表

一、试验研究 Fat-1转基因克隆渤海黑牛研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

二、文献综述 Fat1基因在小鼠及家畜中的研究

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文