短小芽孢杆菌外切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

摘要

外切葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分，是纤维素酶解过程中的限速酶。本实验筛选获得一株可以产生外切葡聚糖酶的短小芽孢杆菌AC-4，克隆获得其外切葡聚糖酶基因(Cbh)，并使其在甲醇毕赤酵母中实现表达。主要研究结果如下:
　　(1)分离获得一株细菌AC-4，外切葡聚糖酶活力为0.625±0.003U/mL，其粗酶液的最适作用pH为9.5，最适作用温度为50℃。由形态学特征和16S rDNA序列分析，可以确定菌株AC-4为短小芽孢杆菌。
　　(2)经PCR扩增，获得了菌株AC-4的外切葡聚糖酶基因片段，其长度为2106bp，编码701个氨基酸，与菌株Bacillus pumilus SAFR-032的外切葡聚糖酶基因序列相似性为94％。
　　(3)将获得的Cbh基因片段与分泌表达载体pMETαA连接构建重组表达质粒pMETαA-Cbh，从而将基因Cbh成功整合到甲醇毕赤酵母菌株PMAD16中。SDS-PAGE分析显示Cbh基因在酵母菌细胞中成功表达，分子量约为78kDa。重组菌株NM-Cbh发酵培养后，外切葡聚糖酶活力可以达到5.4U/mL。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 纤维素酶

1．2 外切葡聚糖酶

1．2．1 外切葡聚糖酶的来源

1．2．2 外切葡聚糖酶活力的测定

1．2．3 外切葡聚糖酶的分子生物学研究

1．2．4 国内外切葡聚糖酶基因克隆和表达的研究

1．3 本论文的研究目的及内容

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 土样

2．1．2 菌种及质粒

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂及药品

2．1．5 主要仪器设备

2．1．6 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的分离与筛选方法

2．2．2 外切葡聚糖酶酶活力的测定方法

2．2．3 粗酶液酶学性质的测定

2．2．4 菌株的鉴定

2．2．5 外切葡聚糖酶基因的克隆

2．2．6 外切葡聚糖酶基因的表达

第三章 结果与讨论

3．1 菌株的分离与筛选

3．2 酶学性质的初步测定

3．2．1 粗酶的最适作用pH

3．2．2 粗酶的最适作用温度

3．3 菌株的鉴定

3．3．1 菌株AC-4的形态特征

3．3．2 菌株AC-4 16S rDNA序列的分析及系统发育树的构建

3．4 外切葡聚糖酶基因的克隆

3．4．1 外切葡聚糖酶基因的PCR扩增

3．4．2 克隆质粒pMD19-T-cbh的构建与转化

3．4．3 菌株AC-4外切葡聚糖酶基因序列的测定及分析

3．5 外切葡聚糖酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

3．5．1 表达质粒pMETαA-Cbh的构建

3．5．2 重组表达质粒pMETαA-Cbh的线性化

3．5．3 重组表达质粒pMETαA-Cbh转化甲醇毕赤酵母PMAD16

3．5．4 SDS-PAGE检测外切葡聚糖酶基因的表达

3．5．5 重组菌株NM-Cbh外切葡聚糖酶酶活力的测定

第四章 全文总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

附录

致谢