CRISPR/Cas9介导敲除内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞FGF5基因

摘要

内蒙古白绒山羊是优秀的绒山羊品种，产出高品质羊绒，在全球享有盛誉。提高羊绒产量一直是绒山羊品种选育的重要任务，分子育种为品种改良提供了新手段。RNA引导的CRISPR/Cas9核酸内切酶系统是近年发展起来的基因定点编辑技术，它通过一段短的RNA序列与DNA靶序列通过碱基互补原则形成双链，后结合Cas9蛋白在DNA靶位点诱导形成双链断裂损伤(double-strandedbreak，DSBs)，DSBs修复时可以在基因组靶位点引入特殊的基因突变，具有设计简单，打靶效率高及能在靶位点形成多种突变的优点。成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor5，FGF5）是影响毛囊周期性活动及绒毛生长的重要生长因子，是一个已知的最强有力的控制毛囊从生长期向休止期转化的因子。敲除FGF5基因可以解除对毛囊生长周期的控制，促进绒毛生长。
　　本文针对内蒙古自绒山羊FGF5基因设计了特异性的“向导RNA”分子（Single guide RNA，sgRNA），并对该sgRNA的潜在脱靶位点进行预测，构建特异于内蒙古白绒山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9表达载体，转染胎儿成纤维细胞，在pool克隆水平上通过Surveyor错配酶酶切pool克隆中的FGF5片段并测序验证，以确定在FGF5基因靶位点发生了基因敲除。随机挑取单个细胞培养，建立单克隆细胞系，对每个单克隆细胞系的基因组进行PCR扩增并测序，筛选出定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系。
　　结果表明:通过生物信息学分析得到靶向于内蒙古白绒山羊基因组FGF5基因的79个潜在靶位点，从中选取了两个sgRNA序列，分别命名为FGF5-1(AGAAGCGCCTCGCACCCAAA)和FGF5-2(CCCTGCCTCCTCCTCCTCCG)。将两个sgRNA序列连接于pX330空载体，得到特异于白绒山羊基因组FGF5基因的CRISPR/Cas9表达载体——pX330-FGF5-1和pX330-FGF5-2。测序表明载体构建正确。
　　利用pX330-FGF5-1和pX330-FGF5-2转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞，Surveyor错配酶酶切和测序验证表明成功的在靶位点进行了特异性切割和突变。利用流式细胞仪通过随机挑选得到24个单克隆细胞系，特异性扩增FGF5基因片段，测序结果表明其中4个细胞系在靶位点发生FGF5基因突变。对这4个敲除FGF5基因的阳性克隆细胞系进行潜在脱靶位点验证，均未发生基因突变。
　　综上所述，本文根据内蒙古白绒山羊FGF5基因的基因组序列设计特异性sgRNA，构建CRISPR/Cas9表达载体，转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选与验证，得到4个定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞的单克隆细胞系，为进一步利用克隆技术培育高产绒量内蒙古白绒山羊新品系提供了条件。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 CRISPR／Cas基因组定点编辑技术的建立

1．1．1 CRISPR／Cas系统的发现与分类

1．1．2 CRISPR／Cas9系统的作用机制

1．1．3 CRISPR／Cas9技术的发展及成熟

1．2 CRISPR／Cas9技术在转基因动物中的应用

1．2．1 在基因敲除中的应用

1．2．2 在基因定点整合中的应用

1．2．3 在基因转录调控中的应用

1．2．4 CRISPR／Cas9技术相比其他基因编辑技术的应用优势

1．3 CRISPR／Cas9的脱靶效应及改进措施的研究

1．4 结语

参考文献

第二章 CRISPR／Cas9表达载体的构建

2．1．材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 化学试剂与耗材

2．1．3 实验材料

2．2 方法

2．2．1 靶位点的选取及gRNA的设计

2．2．2 潜在脱靶位点的确定

2．2．3 CRISPR／Cas9骨架载体的构建

2．2．4 靶位点基因PCR引物设计及反应条件优化

2．3 结果

2．3．1 靶位点的选取与sgRNA的确定

2．3．2 脱靶位点的确定

2．3．3 CRISPR／Cas9骨架载体的构建及测序验证

2．3．4 靶位点基因PCR引物设计及条件优化

2．4 讨论

第三章 定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系筛选及脱靶位点的验证

3．1．材料

3．1．1 主要仪暑设备

3．1．2 化学试剂与耗材

3．1．3 实验材料

3．2 方法

3．2．1 绒山羊胎儿成纤维细腑质体转染体系的优化

3．2．2 CRISPR／Cas9裹达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞

3．2．3 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化

3．2．4 Surveyor酶切验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆

3．2．5 测序验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆

3．2．6 FGF5基因敲除突变单克隆的获得

3．2．7 FGF5基因敲除单克隆测序验证

3．2．8 脱靶位点的验证

3．3 结果

3．3．1 脂质体法转染条件的优化

3．3．2 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化

3．3．3 转染CRISPR／Cas9特异性表达载体后pool克隆Surveyor酶切验证

3．3．4 转染CRISPR／Cas9特异性表达载体后pool克隆测序验证

3．3．5 敲除FGF5基因绒山羊胎儿成纤维细胞阳性单克隆细胞系的获得及鉴定

3．3．6 潜在脱靶位点的验证

3．4 讨论

结论

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢