利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究

摘要

CRISPR/Cas9是发现于古细菌和细菌中的一种获得性免疫防御机制，通过摄取入侵的外源DNA短片段最终形成宿主的间隔序列，从而介导对病毒和质粒的获得性抗性。由于该系统相对于以前的基因编辑方法更简单易行、可靠高效、靶标精准而被广泛应用到多种生物的基因编辑中，成为一个准确打靶的基因编辑工具。
　　本研究以本氏烟草为材料，利用CRISPR/Cas9技术实现本氏烟草内源PDS（Phytoenedesaturase，八氢番茄红素脱氢酶）基因和外源GFP(Green FluorescentProtein，绿色荧光蛋白)基因的编辑工作，建立了本氏烟草CRISPR/Cas9系统基因编辑的瞬时表达系统和稳定遗传转化体系，进而探讨了CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用，为将来开展其它内源基因的生物学功能研究奠定了基础。本论文针对本氏烟草内源基因PDS和外源基因GFP分别预测了3个和4个靶标位点，并设计合成了相应的guide序列和构建了双元表达重组载体。其中，将中间克隆载体psgR-Cas9-At质粒成功地改造成了操作性强的In-Fusion克隆载体psgR-Cas9-IF-At。将成功构建的双元表达重组载体转化到农杆菌中并通过注射法侵染本氏烟草叶片。GFP基因的4个guide序列重组子转化的农杆菌分别侵染转基因本氏烟草16C-NB(16C transgenic Nicotiana benthamiana，16C-NB)叶片（16C-NB过表达GFP基因），通过基因组DNA PCR-RE方法验证CRISPR/Cas9系统的编辑效果，PCR-RE结果显示只有GFP-guide-1和GFP-guide-3有编辑效果。PDS基因的3个靶标序列重组子转化的农杆菌侵染野生型本氏烟草17WT-NB（17 Wild Type-Nicotiana benthamiana）叶片，通过基因组DNA RE-PCR方法验证该系统的编辑效果，RE-PCR结果初步显示PDS-guide-1有编辑效果。
　　本论文将PDS基因的3个guide序列两两组合(即PTG-1+2，PTG-1+3，PTG-2+3)进行多位点编辑试验来进一步验证CRISPR/Cas9系统的编辑效果。将两两组合的guide序列克隆到双元表达载体中并转化到农杆菌中侵染本氏烟草17WT-NB，通过PCR方法检测其编辑效果，PCR结果初步显示只有PTG-1+2有编辑效果。在以上工作基础上，针对PDS-guide-1进行农杆菌介导的叶盘遗传转化实验以期获得单个位点编辑的转基因植株。通过该方法获得了99株转基因植株，PCR结果显示45株阳性植株，但最终成活22株阳性植株，此结果为获得稳定遗传的PDS基因编辑植物打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1．1 CRISPR／Cas9系统的发展及分类

1．1．2 CRISPR／Cas的组成和结构

1．1．3 CRISPR／Cas9系统的作用机制

1．1．4 CRISPR／Cas9系统的应用

1．1．5 CRISPR／Cas9的多位点编辑技术

1．1．6 CRISPR／Cas9与ZFNs和TALENs的比较

1．2 植物组织培养及稳定转化

1．2．1 植物组织培养的发展历程

1．2．2 植物组织遗传转化

1．2．3 植物瞬时表达

1．2．4 模式植物本氏烟草

第二章 实验材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 克隆载体

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 靶位点的预测，guide序列的设计及克隆

2．2．2 重组子的双元表达载体亚克隆

2．2．3 利用In-Fusion克隆技术构建编辑载体

2．2．4 PDS基因多个位点编辑的载体克隆

2．2．5 pGREB32重组载体的构建

2．2．6 感受态细胞的制备

2．2．7 农杆菌介导真空注射法侵染本氏烟草叶片

2．2．8 CTAB法提取烟叶片草基因组DNA

2．2．9 基因组RE-PCR

2．2．10 基因组PCR-RE

2．2．11 本氏烟草瞬时表达系统中多位点编辑效果的检测

2．2．12 本氏烟草叶圆盘转化

第三章 实验结果与分析

3．1 PDS靶位点guide序列的克隆

3．1．1 PDS基因的靶标位点guide序列的克隆

3．1．2 GFP基因的靶标位点guide序列的克隆

3．2 pCAMBIA-guide双元表达重组载体的构建

3．3 本氏烟草瞬时表达编辑效果的鉴定

3．3．1 PDS基因组DNA-RE PCR鉴定

3．3．2 基因组DNA PCR-RE鉴定

3．4 PTG技术多位点克隆

3．5 PDS基因多位点编辑效果的检测

3．6 本氏烟草再生体系的建立及稳定遗传株系的获得

3．6．1 本氏烟草遗传转化体系的建立

第三章 讨论

4．1 瞬时表达的CRISPR／Cas9系统的编辑效果分析

4．2 CRISPR／Cas9系统在本氏烟草稳定遗传转化的探究

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间取得的成果