组蛋白及其变体对小鼠早期胚胎发育的影响

摘要

在卵母细胞和精细胞中存在一类组蛋白H2A和H2B的组蛋白变体，初步研究表明这些组蛋白变体参与早期胚胎基因组的形成，调节早期胚胎的染色体结构、基因表达，在早期胚胎重编程中发挥重要作用。本实验主要以H2A、H2B以及其变体TH2A、TH2B为研究对象，研究它们在过表达情况下对小鼠早期胚胎发育的影响。
　　我们采用PCR技术克隆了小鼠H2A、H2B以及它们的变体TH2A和TH2B全长基因，并将它们分别克隆到pGEM-T载体，通过DNA序列分析与NCBI基因库中的基因比较，证明我们所获得的H2A、H2B、TH2A和TH2B是小鼠的H2A、H2B、TH2A和TH2B的全长基因。然后，把所得的这四个基因分别克隆到pEGFP-C2真核细胞表达载体，将外源基因置于CMV启动子的下游，以便应用于体细胞的表达。为了在小鼠早期受精卵中表达这些组蛋白基因，我们又分别把H2A、H2B、TH2A和TH2B基因克隆到pSP64poly(A)载体，利用SP6RNA聚合酶分别合成H2A、H2B、TH2A和TH2B基因的mRNA，最后通过显微注射方法分别将H2A/H2B或TH2A/TH2B的mRNAs注射到小鼠原核期的胚胎中，研究H2A/H2B或TH2/TH2在过表达条件下对小鼠早期胚胎发育的影响。
　　结果表明，在体外培养90小时后，注射H2A/H2B mRNAs胚胎的囊胚发育率为34.37％，显著低于对照组(43.92％，P＜0.05)，说明在小鼠胚胎发育过程中过表达H2A/H2B对小鼠胚胎早期发育有抑制作用;而注射TH2A/TH2B mRNAs胚胎的囊胚发育率为76.12％，显著高于对照组（43.92％，P＜0.05）以及注射H2A/H2B胚胎组(34.37％，P＜0.05)，该结果表明在小鼠胚胎发育过程中，过表达组蛋白变体TH2A/TH2B可促进小鼠早期胚胎发育。因此，我们的实验结果表明H2A/H2B和TH2A/TH2B对早期胚胎发育具有不同的作用，这些结果对体细胞克隆以及建立iPSc提供了参考价值。

目录

声明

论文说明

摘要

1．1．1 组蛋白

1．1．2 组蛋自变体

2．1 组蛋白功能的研究进展

2．1．1 转录激活与抑制

2．1．2 基因组稳定

3．1 组装核小体

3．1．1 H2A．Z

3．1．3 CenH3

4．1 体细胞重编程技术

4．1．1 体细胞核移植

4．1．2 细胞融合

4．1．3 诱导多能干细胞

4．1．4 组蛋白对重编程的作用

5．1 展望

2．1．1 主要实验器材

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验动物

2．2 重要试剂的配置

2．3 实验方法

2．3．1 引物设计与合成

2．3．2 PCR扩增目的基因

2．3．3 构建T克隆载体

2．3．4 pEGFP-C2质粒提纯

2．3．5 构建pCMV重组载体

2．3．6 构建pSP64 poly(A)重组载体

2．3．7 显微注射RNA

第三章 实验结果

3．1 H2A、TH2A和H2B、TH2B基因序列比对结果

3．2 H2A、H2B和TH2A、TH2B基因全长克隆

3．3．1 双酶切鉴定

3．3．2 DNA序列和氨基酸序列比对结果

3．4 真核表达载体pCMV-H2A、pCMV-H2B和pCMV-TH2A、pCMV-TH2B的鉴定

3．4．1 双酶切鉴定

3．4．2 DNA序列和氨基酸序列比对结果

3．5 重组载体pSP64-H2A、pSP64-H2B和pSP64-TH2A、pSP64-TH2B的鉴定

3．5．1 DNA序列和氨基酸序列比对结果

3．5 外源基因导入受精卵原核

3．5．1 胚胎体外培养发育情况

3．5．2 胚胎体外培养发育统计学分析

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢