截短gRNA降低牛MSTN基因敲除脱靶效率的研究

摘要

肌肉生长抑制素（MSTN）又被称为GDF-8，是在1997年被发现的一种与骨骼肌生长发育相关的负调控因子，其活性的降低或丧失，会引起动物肌肉的过度发育，表现为双肌性状。CRISPR/Cas9技术是由gRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因靶位点并且进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9技术拥有很多优势，但是也有脱靶的弊端。
　　本实验所用的质粒CRISPR/Cas9-B，包含针对牛MSTN基因第二外显子而设计的gRNA，可以引导Cas9蛋白作用于AGAACCAGGAGAAGATGGACTGG位点。然而通过检索，发现除了牛2号染色体上的打靶位点，在4号染色体receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2的5’端有17个碱基与gRNA匹配，1号染色体leukocyte immunoglobulin-like receptor的5’端有14个碱基与gRNA匹配，10号染色体kinectin isoform X7的5’端有16碱基与gRNA匹配，这些位点均为潜在脱靶点。为了检测脱靶效率，在这些位点两端分别设计引物用于PCR检测。为降低CRISPR/Cas9的脱靶效率，分别设计了截短1bp、2bp、3bp和5bp的gRNA，利用这些截短的gRNA构建CRISPR/Cas9质粒，分别命名为CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15。使用电转染的方法将这些质粒分别导入牛胎儿成纤维细胞中，利用流式细胞仪进行单细胞分离，并在96孔板内培养，以此获得基因敲除的细胞株。提取基因组，进行PCR扩增和电泳检测，将有目的条带的样品进行测序分析。最后比较截短1bp、2bp、3bp、5bp的gRNA所构建的CRISPR/Cas9质粒与CRISPR/Cas9-B质粒在打靶和脱靶位点的作用效率。结果显示，在MSTN打靶位点CRISPR/Cas-B、CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15引起基因突变的效率分别为62.16%、17.39%、7.69%、74.29%和3.85%；在4号染色体脱靶位点（2号引物）的作用效率分别为52.86%、0、0、8.82%和0；在1号染色体脱靶位点（9号引物）的效率分别为44.87%、51.72%、86.36%、0和50%；在10染色体脱靶位点（26号引物）的作用效率都为0。CRISPR/Cas9-17质粒在MSTN位点引起基因突变的效率比CRISPR/Cas9-B质粒的效率高，同时在三个脱靶位点的作用效率有明显降低，并且在统计学上有极显著差异（P＜0.01）。CRISPR/Cas9-17质粒达到了在不影响目的基因打靶效率的同时减小了脱靶现象的目的。
　　本研究成功地在牛胎儿成纤维细胞敲除了牛MSTN基因，同时通过截短gRNA长度使CRISPR/Cas9技术的脱靶问题得以改善，使CRISPR/Cas9技术在牛羊育种领域能更好的发挥作用，为家畜和畜牧育种带来更大的机遇。

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