甜瓜ACS基因家族成员的鉴定及CmACS7和CmACS11的克隆与遗传转化

摘要

甜瓜（Cucumis meloL.）为一年生匍匐或攀援草本植物，是重要的园艺经济作物，在世界上广泛栽培，它具有独特的生物特性和重要的经济价值。甜瓜是除了番茄之外另一种可选择且非常重要的研究肉质型果实发育的模式植物，乙烯在其果实发育成熟中存在着明显的变化。ACC合成酶（1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶，ACS）是乙烯生物合成过程中催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的关键限速酶。
　　以甜瓜品种河套蜜瓜（Cucumis meloL.cv.Hetao）为实验材料，应用生物信息学的方法从其基因组数据库中鉴定筛选出ACS基因家族的全部成员，共鉴定得到11个甜瓜ACS基因。内含子-外显子结构和系统发生与进化关系分析结果表明，甜瓜ACS基因中，CmACS1和CmACS2属于Ⅰ型，CmACS7、CmACS10、CmACS11和CmACS12属于Ⅱ型，CmACS3和CmACS5属于Ⅲ型。启动子预测结果显示，甜瓜ACS基因启动子序列中，主要含有参与防御和胁迫响应的顺式作用元件和参与响应各种激素的顺式调控元件。
　　半定量和实时荧光定量检测结果表明，甜瓜ACS基因表达具有组织特异性，CmACS1和CmACS11在果实跃变期表达量升高，CmACS10和CmACS12在叶中表达量较高，CmACS7和CmACS11在子房中表达量均相对较高。
　　应用RT-PCR法克隆了CmACS7和CmACS11基因全长cDNA，并分别构建CmACS7、CmACS11和实验室已克隆基因CmACS1的超表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体。应用子房注射法转化甜瓜，PCR检测显示转化效率为12.5%-57%。通过测序分析，编辑载体pCRI-CmACS1、pCRI-CmACS7转化的阳性植株没有发生基因编辑，pCRI-CmACS11、pCRI-CmACS1/11和pCRI-CmACS7/11转化的阳性植株共有11株发生了基因编辑。

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