小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立

摘要

子代基因组可以来源于父本及母本双方，或者其中一方（即孤雄或孤雌），后者的遗传方式在自然界中尤为罕见，但却为探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进行了探讨。
　　首先，采用化学成分明确的培养液来培养小鼠二倍体孤雌囊胚，培养液成分包括：基础培养基N2B27、激活素A（ActivinA）、成纤维细胞生长因子（bFGF）以及血清替代物（KSR），这种建系方法可以高效率的获得小鼠孤雌胚胎来源的上胚层干细胞（parthenogenetic epiblast like stem cell，下文称之为Pa-AFSCs），该细胞系的形态特征及部分鉴定结果如下：
　　1.克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果显示，Pa-AFSCs与上胚层干细胞（Epiblaststem cells,EpiSCs）相似。
　　2.免疫荧光染色结果显示：Pa-AFSCs表达Nanog的细胞明显少于对照组胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs），而其表达Gata6的细胞明显多于完全阴性的ESCs，H3K27me3的结果显示几乎全部Pa-AFSCs细胞皆表现为一条X染色体处于失活的状态。
　　3.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示：Pa-AFSCs的Oct4,Nanog,Gata4,Gata6和Eomes的转录水平与EpiSCs相差无几，但滋胚层标志基因Elf5和细胞周期相关基因cMyc的转录水平明显高于EpiSCs。
　　4.畸胎瘤及嵌合体实验结果：畸胎瘤的实验结果显示未观察到明显畸胎瘤形成。实验获得1枚6.5天嵌合原肠胚，胚胎嵌合率4.2%，嵌合部位胚外外胚层（extraembryonic ectoderm，EXE）。
　　5.生长曲线结果显示，来源于ICR小鼠的Pa-AFSCs生长速度明显高于来源于129小鼠的Pa-AFSCs。
　　随后，进一步将得到的Pa-AFSCs置于包含ActivinA、骨形态发生蛋白BMP4、CHIR99021、白血病抑制因子LIF（即ABCL培养体系）的培养液中进行诱导培养，得到新型小鼠多能性干细胞系，命名为：Ja-ASCs。其克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果与对照组ESCs相比，无明显差别，可稳定传代至40代以上。免疫荧光染色结果显示：与对照组Pa-AFSCs相比，失活的X染色体重新活化。RT-qPCR实验结果显示：比较于Pa-AFSCs，Oct4,Nanog和Klf4的表达上调，Gata4和中胚层标志基因Sox17的转录下调。另外发现Cdx2的转录水平明显高于对照组Pa-AFSCs。嵌合体结果显示Ja-ASCs不具备贡献着床后胚胎的能力。
　　综上所述，本实验由小鼠孤雌激活的囊胚建立了两种新型的细胞系：Pa-AFSCs和Ja-ASCs。从形态特征以及干细胞的某些特征来看，Pa-AFSCs接近于EpiSCs，而Ja-ASCs更类似于ESCs。然而Pa-AFSCs无法形成畸胎瘤，Ja-ASCs也无法贡献于着床后的嵌合体胚胎中，具体分子机制还有待进一步研究。

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