aFGF、bFGF在膀胱癌中的表达，对膀胱癌细胞株EJ细胞的作用及机制的研究

摘要

膀胱移行细胞癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤。浅表性肿瘤容易复发；而侵袭性肿瘤或有转移者预后不佳。虽然手术技巧和化疗方案不断进步，但膀胱肿瘤的治疗目前仍不十分满意。因此有必要深入了解膀胱肿瘤的发病原因和机制，以期为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。有研究显示酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)等肽类生长因子与膀胱肿瘤的发生和发展密切相关，aFGF和bFGF在膀胱移行细胞癌患者尿中的水平增高，且与分期相关。该研究拟从mRNA水平上检测aFGF，bFGF及FGFR-1在人膀胱移行细胞癌组织中的表达，探讨它们的表达与膀胱癌发生，发展的关系。该研究还以膀胱癌细胞株EJ细胞为研究对象，观察aFGF，bFGF对EJ细胞增殖的影响；并对EJ细胞施加Genistein和PD98059，观察Genistein和PD98059对EJ细胞增殖的影响，推测肿瘤细胞的信号传导机制，探讨Genistein和PD98059是否对膀胱肿瘤有治疗作用。 实验材料与方法: 一、实验材料 标本：63例膀胱移行细胞癌标本来自1999-2002年间在研究者所在科手术治疗的患者，标本常规福尔马林固定，石蜡包埋；其中20例患者的新鲜标本冻存于-70℃冰箱，留作RT-PCR；用于对照的6例正常膀胱组织均来自行开放手术的BPH患者，所有标本均经病理证实。 细胞株：膀胱癌细胞株EJ细胞购自北京大学泌尿外科研究所。 试剂： 1.RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。 2.aFGF原位杂交(ISH)及原位末端标记细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒购自武汉博士德公司。 3.aFGF、bFGF购自北京邦定公司；Genistein购自Sigma公司；PD98059购自Promega公司； 4.PRMI1640培养基、新生牛血清购自Gibco公司。 5.MTT购自Fluka公司。 6.(γ-P32)ATP购自北京亚辉生物制品公司。 二、实验方法 1.RT-PCR检测aFGF、bFGF及FGFR-1的mRNA在正常及膀胱癌组织中的表达。ISH检测aFGF的mRNA在膀胱癌组织中的定位表达。 2.用不同剂量的aFGF，bFGF，Genistein，PD98059刺激EJ细胞；MTT法检测细胞增殖；TUNEL法检测细胞凋亡。 3.检测aFGF对EJ细胞的ERK活性的影响，推测肿瘤细胞内信号传导的途径。 实验结果 1.RT-PCR证实aFGF、bFGF及FGFR-1的mRNA在膀胱癌组织中的表达明显高于它们在正常组织中的表达(P＜0.01)，且与分期呈正相关。ISH同样证实aFGFmRNA的表达与肿瘤分期呈正相关，aFGF的染色主要位于肿瘤的间质，以血管周围为著。 2.aFGF、bFGF均可明显地促进EJ细胞的增殖，增殖程度与药物浓度成正相关(p＜0.05)；Genistein对EJ细胞增殖有抑制作用(p＜0.05)，而且对于aFGF、bFGF诱导增殖的EJ细胞的抑制作用更加明显。PD98059对EJ细胞的增殖同样有抑制作用，而且对于aFGF诱导增殖的EJ细胞的抑制作用更为显著(p＜0.05)。TUNEL法发现Genistein能促进EJ细胞的凋亡。 3.aFGF刺激后，EJ细胞的ERK活性明显增强，与aFGF呈剂量依赖关系。 讨论: 膀胱移行细胞癌是常见的恶性肿瘤，在我国其发病率居泌尿外科恶性肿瘤之首，虽然手术技巧和化疗方案不断进步，但是其治疗效果仍不十分满意。浅表性肿瘤容易复发，而一旦发展为侵袭性肿瘤或出现转移则预后很差。因此非常有必要深入了解其病因和发病机制，为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。近来的研究显示酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等肽类生长因子与膀胱肿瘤的发生、发展密切相关。aFGF和bFGF是成纤维细胞生长因子家族中最具代表性的成员，一级结构分析表明，二者之间有55％的同源性。它们对中胚层和神经外胚层来源的细胞有促分裂作用。它们是强有力的血管生成因子，过度表达会引起细胞转化，与多种肿瘤的发生密切相关。 Chopin等人发现膀胱移行细胞癌患者尿液中的aFGF水平较正常升高，且与肿瘤的分期和转移呈正相关，他们应用免疫组化方法发现aFGF在膀胱癌组织中的表达也明显增高并与分期呈正相关。Nguyen等人证实膀胱移行细胞癌患者尿液中的bFGF水平增高并与肿瘤的分期呈正相关。本研究应用RT-PCR技术，在mRNA水平上检测膀胱癌组织中的aFGF、bF-GF和FGFR-1的表达，我们发现aFGF、bFGF和FGFR-1在膀胱癌组织中的表达均显著高于正常对照。并与肿瘤的分期密切相关，而与分级无明显相关，说明aFGF、bFGF主要与肿瘤的侵袭性有关，aFGF、bFGF和FGFR-1可能形成了一个自分泌或旁分泌通路，在膀胱癌的发生和侵袭中起重要作用。该研究应用ISH证实aFGF的染色主要位于肿瘤的间质细胞，以血管周围最为显著，提示aFGF与膀胱肿瘤的血管生成密切相关，而异常的新生血管的形成，不仅是膀胱肿瘤早期复发的重要因素，也是肿瘤获得侵袭和转移能力的重要标志。此组中有转移者的aFGF均为强阳性表达，显著高于对照组，说明aFGF与膀胱肿瘤的转移密切相关。因为aFGF、bFGF和FG-FR-1与膀胱肿瘤的侵袭、转移密切相关，可以将它们的表达作为判断膀胱肿瘤预后的辅助指标。 为进一步研究aFGF、bFGF与膀胱肿瘤的关系，研究者以膀胱癌细胞株EJ细胞为研究对象，观察aFGF、bFGF对EJ细胞增殖的影响，MTT法证实aFGF、bFGF均对EJ细胞有促进增殖的作用，且随药物浓度升高，促增殖作用加强。Valles等发现aFGF不仅可以促进小鼠膀胱癌细胞株NBT-2细胞的增殖，而且还可以使细胞形态发生变化，细胞运动性增强。这些结果进一步证实了用RT-PCR和ISH得到的结论：aFGF、bFGF在膀胱肿瘤的发生、发展过程中起重要作用，与膀胱肿瘤的侵袭、转移密切相关。该文推测：不是膀胱肿瘤的侵袭使aFGF、bFGF的表达升高，而是aFGF、bFGF的过度表达增加了膀胱肿瘤的侵袭性。 aFGF、bFGF必须与其受体结合才能发挥作用，而酪氨酸蛋白激酶(TPK)部分是FGFR信号传导的主要部位。Genistein是从大豆中提取的异黄酮染料，是特异性的TPK抑制剂。有研究证实Genistein对多种肿瘤细胞具有抑制增殖的作用，该实验观察到，加入TPK抑制剂Genistein后，EJ细胞的增殖明显受到抑制，抑制程度与Genistein呈剂量依赖关系，说明EJ细胞的增殖主要是由TPK活化介导的。而且Genistein对aFGF、bFGF诱导增殖的EJ细胞的抑制作用明显大于对照组，这可能是因为aFGF、bFGF是通过提高FGFR-1的表达水平，促使TPK活性加强来发挥作用的，因而TPK抑制剂Genistein的抑制作用更为显著。本试验采用TUNEL技术证实，Genistein能促进细胞的凋亡。总而言之，Genistein通过抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期进展而对EJ细胞产生直接作用，可能为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。 近来，随着对细胞信号传导途径研究的日益深入，发现癌变与异常的信息传递密切相关。TPK信号传导系统是一种重要的信号传导途径。ERK是TPK的下游信号传导途径，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。该通路主要促进细胞的存活。Bryckaert等进行的研究发现，aFGF能引起ERK2的激活，并使抗凋亡蛋白Bcl-X维持于高水平，从而促进细胞的增殖、存活，他们认为ERK2决定aFGF的生物学功能。Udayakumar等发现aFGF通过增强ERK1/2的活化来促进前列腺癌细胞株LNCaP中Promatrilysin(与侵润有关)的表达；ERK激酶抑制剂PD98059可以通过抑制ERK1/2的活化来阻断aFGF诱导的Promatrilysin的表达。该研究证实，aFGF可以使EJ细胞的ERK活性增强，且与aFGF呈剂量依赖关系。加入PD98059后，EJ细胞的增殖明显受抑制，且随PD98059浓度的升高，抑制作用加强，说明该细胞株的增殖主要是由ERK活化介导的。aFGF通过增强ERK的活性来起作用。PD98059通过阻碍ERK信号传导，对EJ细胞的增殖有抑制作用，而且对于aFGF诱导的EJ细胞增殖的抑制作用更加明显；PD98059能否成为治疗膀胱肿瘤的药物尚需进一步的研究。 结论: 1.aFGF、bFGF和FGFR-1在膀胱移行细胞癌中的表达增强，且与分期呈正相关，可作为判断膀胱肿瘤预后的辅助指标。 2.aFGF的染色主要位于肿瘤的间质血管周围，aFGF的表达与膀胱肿瘤的转移密切相关。 3.aFGF、bFGF可以促进膀胱移行细胞癌细胞株EJ细胞的增殖。 4.Genistein能抑制EJ细胞的增殖，促进细胞的凋亡；对aFGF、bFGF诱导的EJ细胞增殖有抑制作用，可为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。 5.ERK通路是aFGF诱导EJ细胞增殖的重要细胞内信号传导途径。 6.PD98059能抑制aFGF诱导的EJ细胞增殖，可为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。

目录

英文缩略语

论文一aFGF、bFGF和FGFR-1在膀胱移行细胞癌中的表达

前 言

材料与方法

结果

论文图片

讨 论

结 论

参考文献

论文二Genistein对aFGF、bFGF诱导的EJ细胞增殖的抑制作用

前 言

材料与方法

结果

论文图片

讨 论

结 论

参考文献

论文三PD98059对aFGF诱导的EJ细胞增殖的抑制作用

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结果

讨 论

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参考文献

本研究创新点

致 谢

综述FGFs与膀胱肿瘤

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