口腔粘膜人工固有层的实验研究与口腔粘膜固有层的临床应用

摘要

组织工程技术是创伤修复领域的新兴技术，使应用少量组织获取大量细胞并用于修复大块组织缺损成为可能，有学者将培养好的口腔粘膜上皮片覆盖修复患者口腔粘膜缺损，避免了供皮区的负损伤。 本文对患儿唇裂术后瘢痕组织形态进行研究；利用唇裂手术中将扔掉的唇粘膜组织，自体移植于皮肤切口内，观察移植术后的发展变化。 材料和方法： 1.1材料 主要试剂：DMEM，胰蛋白酶，胎牛血清，1.8～1.9mg/ml鼠尾Ⅰ型胶原：大鼠尾由我校提供，壳多糖，两性霉素B。 1.1.2主要器械：CO2培养箱，超净工作台，倒置相差显微镜，低温高速离心机，24孔板，游标卡尺，JEM-1200EX透射电镜。 1.2实验动物与方法Wistar大鼠，21周至25周龄，体健，由我校实验动物部提供。 1.2.1 种子细胞的获取及培养：组织块培养法进行，大鼠颊、腭粘膜成纤维细胞原代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM液(serum contai-ning medium SCM)。胰酶消化，按l:3比例传代培养。 1.2.2胶原网架组织工程口腔粘膜固有层(Fibroblast-populated col-lagen lattice FPCL)的制作，将第5至9代OMF制成细胞悬液，按文献中的配方，在24孔板中制成，每孔0.4ml，内含细胞3.5×104，置37℃，5％CO2孵箱中,1h后凝固，每孔加人0.3ml SCM，3天换液一次。 1.2.3壳多糖胶原网架组织工程口腔粘膜固有层(Fibroblast-popttla-ted chitosan collagen lattice FPCCL)的制作：将第5至9代OMF制成细胞悬液，参照朱氏方法加入细胞悬液，混匀，将该混合液吸入24孔板中，其余操作同上。 1.2.4 细胞标记：24孔板中FPCL和FPCCL制成后第3天，以含10μM BrdU的上述SCM培养液培养48h后，换SCM，备移植手术用。 1.2.5颊粘膜缺损动物模型制作和分组：21至25周龄Wistar大鼠21只，分为二组，对照组9只；FPCCL移植组12只。大鼠在常规条件下饲养。 1.2.6全层皮肤缺损动物模型制作和分组：Wistar大鼠41只，分为三组，对照组13只；FPCL移植组14只；FPCCL移植组14只。 手术过程：按同样方法，在大鼠背部中央做1个圆形全层皮肤缺损区，即为全层皮肤缺损动物模型。对照组的皮肤缺损区直接敷以无菌油纱；将培养5天的FPCL膜和FPCCL膜取出，无菌剪刀修剪，分别平放于皮肤缺损区，然后覆盖凡士林油纱和干纱布，荷包缝扎，固定。 大鼠术后皮肤组织取材活检时间安排及取材方法：术后第4、7、14、21和26天时取材，取下受植区全层新生组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片，备用。 组织染色法：将以上五天的石蜡切片，进行苏木素-伊红染色，将以上术后第4、7、14、21天的石蜡切片进行SP法免疫组化染色，按试剂盒说明书操作，DAB显色。 1.2.7将以上唇裂的石蜡切片行H、E染色，Weigert弹力纤维染色，戊二醛固定的标本常规处理，透视电镜观察。 1.2.8手术方法：下三角瓣法，鼻槛区域肌层缝合后，将上述剪碎的固有层组织放入该区域的真皮与皮下层位置，然后缝合该处皮肤。术后随访观察记录。 1.3观察指标： 1.3.1大体观察：在术后第1、4、7、14和21天，观察五组大鼠有无感染发生，创面愈合情况，有无移植物脱落，有无出血。鼻槛区手术切口愈合情况。 1.3.2创面大小测量及统计比较：术后第4、7、14和21天，将三组大鼠的背部创面和术后第4、7、14天，另二组大鼠的口内颊部创面，按照Ste-phens方法，测量每个创面直径，以均数±标准差表示，统计分析。 1.3.3光学显微镜下观察，颊粘膜缺损动物模型组术后第7、14、21天的愈合情况；皮肤缺损动物模型组术后第4、7、14、21和26天的愈合情况。 以细胞核呈深棕色着色为BrdU阳性细胞。患者唇裂瘢痕组织结构。 1.3.4 电镜下观察，唇裂瘢痕中OMF的情况。、2.1 大体观察：颊粘膜缺损动物模型组，术后第4天FPCCL组12只大鼠中，9只大鼠颊部荷包在位良好，无明显红肿。术后第七天拆线，受植区创口被浅黄色膜覆盖,周围无红肿。术后14天，FPCCL新生粘膜表面有光泽，颜色与周围粘膜颜色相似。移植术后第21天FPCCL组新生粘膜色泽同周围组织的一致。 皮肤缺损动物模型组，术后第1天FPCL组和FPCCL组各有一只大鼠背部荷包被爪抓掉，其余26只大鼠术后均未发生感染。移植第7天，三组创面均被结痂或少许纱布覆盖。移植第14天，FPCL组大鼠创口结痂均脱落，创面完全被新生表皮覆盖。FPCCL组与对照组各一例受植区新生皮中央有少许结痂(第17天脱落)，其余受植区情况与FPCL组的一致。移植第21天，三组大鼠背部所有创面的新生皮肤光滑，颜色与正常皮肤色相似，均无体毛。 2.2 创面直径测量结果：颊粘膜缺损动物模型组，移植第7天时，FPCCL组的直径与对照组间有显著差异(P<0.05)，第14天时，无显著差异。皮肤缺损动物模型组，移植第7天时，FPCL.组与FPCCL组、对照组有非常显著差异(P<0.01)，第14、21天时，无显著差异，FPCCL组直径最大(P>0.05)。 2.3显微镜下观察：颊粘膜缺损动物模型中，术后第七天，FPCCL组创面不完全被薄层新生上皮细胞覆盖。固有层中新生肉芽组织富含毛细血管、炎性细胞、成纤维细胞。免疫组化染色见阳性成纤维细胞分布于固有层中。植入的凝胶网架颜色、形态与周围组织无法区别。 移植术后14天，FPCCL组新生上皮厚，有较大的钉突，固有层中成纤维细胞与炎性细胞仍较密集，毛细血管数量稍较术后第7天时减少。免疫组化染色，可见固有层中的阳性成纤维细胞。对照组新生上皮钉突明显，上皮细胞3至4层。 术后第21天，FPCCL组新生上皮厚，钉突粗大。新生固有层中细胞数量减少，有少量毛细血管，可见固有层中BrdU阳性的成纤维细胞。对照组新生黏膜结构与实验组的相似。皮肤缺损动物模型组，移植术后第4天，FPCL组、FPCCL组受植创面最表面坏死组织，与下方肉芽组织分离。肉芽组织中有大量炎性细胞，和较多长梭型成纤维细胞，新生毛细血管。新生组织中细胞非常密集。免疫组化染色显示，阳性成纤维细胞出现在新生肉芽组织中，对照组创面中病理组织结构与实验组类似。术后第7天，以上两实验组受植创面表皮细胞正在生长，呈剑尖状向肉芽组织与坏死组织之间穿行。免疫组化染色显示，阳性成纤维细胞出现在肉芽组织的细胞最密集处。对照组与实验组结构相似。移植第14天，两实验组受植区完全表皮化，有钉突，表皮已分层，基底细胞层完整，最表面有角化物，新生真皮中可见BrdU阳性OMF，对照组创面已完全表皮化，无钉突。移植术后第21天两实验组完全表皮化，可见钉突，真皮中新生胶原纤维细小，含较多毛细血管。BrdU阳性成纤维细胞在真皮中仍能看到。对照组完全表皮化，钉突极少，基底细胞层完整，其浅面有1-2层细胞，最表面是角化层，新生瘢痕组织与正常皮肤相比仍有较多的毛细血管，真皮层中的细胞间质纤维仍没有正常真皮的粗大。术后26天，两实验组在H E染色下的新生组织结构与术后第21天的非常相似。 2.4 对患者的研究：光学显微镜下，唇裂皮肤切口瘢痕组织表皮层细胞分层清晰：基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层和角化层，偶见微小的表皮钉突，使基底膜时常与皮肤表面平行。而上唇粘膜瘢痕中上皮细胞分层清晰，从深层至浅层依次为：基底细胞层、中间层和表层，上皮钉突长而大。皮肤瘢痕的真皮层中，胶原纤维呈粗大的束状，伴纤细的弹力纤维，缺少小动、静脉和皮肤附属器。成纤维细胞数量少，核的形态为长梭形。上唇口腔粘膜瘢痕固有层中，易见毛细血管，形成的固有层乳头区富含血管，数量比瘢痕真皮乳头区的血管数量多。固有层中胶原纤维束细，弹力纤维极少，成纤维细胞数量少，呈长梭形。电镜下，粘膜瘢痕中成纤维细胞，细胞浆不丰满，缺少发达的粗面内质网；皮肤瘢痕中，2个成纤维细胞，胞浆不丰满，形态细长。 2.5 21 例唇裂手术后患儿，术后7天观察中，鼻槛区域即唇组织自体移植区的皮肤和手术切口，无明显红肿，皮肤创口甲级愈合。15例术后一年半后随访，1例术后4年随访，见移植粘膜固有层的鼻槛处手术瘢痕平坦，质地、颜色与周围皮肤一致；2例未到腭裂手术时间；3例未再到我科做腭裂手术。 1.0MF做为修复重建颊粘膜全层缺损、皮肤缺损的新种子细胞是可行和有效的。 2.胶原凝胶、壳多糖-胶原凝胶组织相容性良好，起粘膜固有层、皮肤真皮的细胞外基质作用。壳多糖-胶原凝胶在动物体内限制受植区收缩变小方面优于单纯胶原凝胶。 3.FPCL和FPCCL两种组织工程口腔粘膜固有层做为颊粘膜缺损、皮肤缺损区永久性替代物是可行和有效的。FPCL和FPCCL两组新生皮肤的质量高于对照组的。 4.患儿唇粘膜手术切口瘢痕不同于唇皮肤切口瘢痕的特点：前者形成的钉突长而大，固有层乳头狭长，几乎达新生上皮表面，乳头中富含毛细血管，胶原纤维束较细，弹力纤维极少。 5.患儿唇粘膜固有层自体移植于上唇皮肤切口内无排斥反应，是可行的；自体移植的固有层组织对皮肤创口的愈合具有促进作用。提供了临床参考。

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英文论著摘要

论文一组织工程口腔粘膜固有层修复口腔颊粘膜缺损的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结 论

论文二组织工程口腔粘膜固有层修复皮肤缺损的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结 论

论文三唇裂术后瘢痕的组织学研究与唇粘膜固有层的临床应用

实验材料与方法

结果

讨论

结 论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综 述:口腔粘膜成纤维细胞与皮肤组织工程

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