乙型肝炎病毒母婴传播机制的初步研究

摘要

全世界约有20亿人感染乙肝病毒，约有3.5亿人为慢性乙型肝炎病毒携带者。中国是乙型肝炎的高流行区，乙肝病毒的平均携带率为9.7％，慢性乙型肝炎患者三千多万，人群总的HBV感染率高达57.8％。HBV的感染与肝硬化和肝癌的发生密切相关。 母婴传播是我国乙肝病毒感染的主要传播途径之一。由母婴传播所引起的HBV感染约占我国婴幼儿乙肝病毒感染的1/3，由于感染后95％的婴幼儿将发展为HBV的慢性感染，所以是我国乙型肝炎高发的一个重要因素。研究HBV母婴传播机制及其预防措施是国内外学者所共同关心的问题。阻断HBV的母婴传播是控制乙型肝炎流行的关键。乙型肝炎疫苗对HBV的母婴传播有很好的阻断作用，我国自1988年起推行新生儿乙型肝炎疫苗预防接种计划以来，新生儿HBV感染率已经明显降低。但是仍有10％左右HBV血清学标志物阳性母亲的婴儿虽然接种了乙型肝炎疫苗，但未得到保护，发生免疫阻断失败，成为HBV感染者。大部分母婴传播免疫阻断失败是因宫内感染引起。HBV宫内传播的机制目前存在一些假说，包括胎盘渗漏学说，胎盘感染学说，外周血单个核细胞(PBMC)感染学说，生殖细胞传播学说等。在HBV宫内传播过程中，胎盘屏障的功能发挥重要作用。HBV变异也是导致免疫失败的主要原因。HBsAg“a”决定簇是HBsAg的主要抗原决定簇，维持HBsAg的抗原性，此区保守的氨基酸一旦被替代，即可改变HBsAg的抗原性，不再被疫苗刺激所产生的抗体中和，造成免疫失败。 我们检测了乙肝疫苗免疫阻断HBV母婴传播失败母亲和儿童的HBVS基因的变异，并对HBV血清学标志物阳性孕妇的胎盘和引产胎儿的组织器官进行HBsAg和HBcAg的免疫组织化学染色、用TUNEL技术检测了胎盘细胞的凋亡，并对母亲外周血、胎儿脐血和引产胎儿组织器官进行了HBV DNA的定量分析，探讨HBV宫内传播的机制和宫内感染的诊断。为了进一步证实HBV对滋养层细胞的感染，我们建立了滋养层细胞的体外培养模型，并且应用滋养层细胞系JEG－3细胞，在体外模拟体内HBV对滋养层细胞的感染情况，通过细胞免疫荧光和免疫组织化学技术，检测滋养层细胞中HBsAg和HBcAg的表达，并对滋养层细胞内的HBV DNA进行定量分析。我们还检测了滋养层细胞的凋亡，探讨了细胞凋亡在HBV宫内传播中的意义。 材料与方法 一、临床部分 1．研究对象： (1)血清HBV DNA均阳性的7对母子作为研究对象，儿童生后均接受乙肝疫苗全程免疫。留取血清-20℃冻存，待检。 (2)正常分娩或引产的HBV血清学标志物阳性孕妇20例，6例引产终止妊娠，14例正常分娩，留取孕妇外周血和胎儿脐血，分离血清，－20℃保存。胎盘组织、引产胎儿心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏福尔马林固定，制作组织石蜡切片标本，同时留取上述组织－80℃保存。新生儿出生后接受乙肝疫苗和HBIG全程免疫，6个月后随访。 2．实验方法： (1)孕妇、脐血及免疫失败母子血清HBV DNA的检测：通过荧光定量PCR方法进行检测。 (2)提取血清HBV DNA并进行PCR扩增。设计1对HBV S区引物，扩增片断长度492bp。 引物序列： P1(正义)5’－CTgggACCCTgFgACgAAC-3’(ntl35—154) P2(反义)5’－AAgCCCAggACgATgggATg-3’(nt607-626) (3)PCR扩增产物进行核苷酸序列测序。 (4)HE染色：观察胎盘及组织器官的形态学。 (5)免疫组织化学染色：检测胎盘和胎儿组织中的HBsAg和HBcAg。 (6)引产胎儿组织HBV DNA的检测：通过蛋白酶K(PK)消化裂解法提取组织DNA，并进行HBV DNA荧光定量检测。 (7)末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口标记法(TUNEL)：检测胎盘细胞凋亡。 3．统计学分析： (1)通过BioEdit、DNAsis和DNAclub软件对HBV S基因测序结果进行基因分型、核苷酸和氨基酸变异及对病毒蛋白二级结构预测的比较分析。 (2)实验数据用X±s或 X<,ln>±s<,ln>表示，用SPSS for Windows 10.0软件对数据进行统计学分析。P<0.05为显著性差异界限。 二、体外实验部分 1．研究对象：人早孕绒毛膜滋养层细胞的原代培养和滋养层细胞系JEG一3的传代培养：早孕胎盘绒毛通过胰蛋白酶/DNA酶联合消化法获得单个细胞，经Percoll密度梯度离心对滋养层细胞进行分离和纯化，并应用鼠尾胶原促进细胞贴壁，进行原代培养。滋养层细胞系JEG-3传代后待细胞处于对数生长期进行试验。与HBV感染血清共同孵育不同时间并进行检测。 2．实验方法： (1)细胞免疫荧光染色：用特异的细胞角蛋白-7(CK-7)抗体和波形蛋白抗体鉴定培养的原代细胞。HBsAg单克隆抗体检测HBV对滋养层细胞的感染。 (2)细胞免疫组织化学染色：HBcAg多克隆抗体检测HBV对滋养层细胞的感染。 (3)滋养层细胞内HBV DNA的检测：蛋白酶K(PK)消化裂解法提取细胞中的DNA，并进行HBV DNA荧光定量检测。 (4)TUNEL：检测HBV感染后滋养层细胞的凋亡。 3．统计学分析： 实验数据用 ±s表示，用SPSS for Windows 10.0软件对数据进行统计学分析。P<0.05为显著性差异界限。 1．7对乙肝病毒母婴传播免疫阻断失败母子血清HBV DNA均为高水平(>1×10<'7>Copy/m1)，母子间 HBV DNA水平无显著性差异。2.7对母子中，2对母子为基因B型，5对母子为基因C型。 3．7对母子间HBV S基因序列比较结果显示： (1)母子间所测基因序列的同源性为99％-100％。除基因B型中有1例子女在540位核苷酸发生了A→G突变外，其余母子间基因序列完全相同，包括发生变异的位点在母子间也完全一致。 (2)发生HBV母婴传播阻断失败的母子HBV-S基因核苷酸测序结果与选定的标准株进行比较，在基因B型的2对母子中共同存在381位A→G，400位A→G，436位A→G，520G→A，551位T→A的变异，两对母子在499位和508位核苷酸序列均存在变异分别为499位C→A/C→G，和508位G→A/G→C。基因C型的5对母子共同存在295位G→A，和529位G→A的变异，其中1对母子包括一位母亲和其2个子女均存在369位C→T变异，另一对母子存在456位C→T变异，还有一对母子存在531位G→A变异。 4．核苷酸变异对氨基酸表达的影响，基因B型中381位A→G的变异导致76位氨基酸发生Y(酪氨酸)→C(半胱氨酸)的变异，551位T→G的变异导致133位氨基酸L(亮氨酸)→M(蛋氨酸)的变异，而该例在540位发生A→G核苷酸变异的子女导致129位氨基酸Q(谷氨酰胺)→R(精氨酸)的变异。基因C型中，295位G→A的变异导致47位氨基酸A(丙氨酸)→T(苏氨酸)，529位G→A的变异导致125位氨基酸A(丙氨酸)→T(苏氨酸)的变异。 5．通过预测HBV S基因变异导致病毒氨基酸表达的变异可能影响病毒蛋白的二级结构。 6．胎儿脐血HBV DNA水平与母血HBV DNA水平相关，母血HBVDNA高水平(≥10<'7>)时脐血HBV DNA阳性率明显增高。胎儿脐血HBV DNA水平显著低于母血HBV DNA水平。 7．胎盘及引产胎儿组织器官HBsAg及HBeAg的免疫组织化学检测 胎盘组织的免疫组织化学染色结果：胎盘组织可见HBsAg免疫组织化学染色阳性，但未发现胎盘组织HBeAg免疫组织化学染色阳性。胎盘组织中HBsAg染色阳性细胞最多见于绒毛表面的滋养层细胞，亦可见于绒毛间质细胞和胎盘绒毛毛细血管内皮细胞。胎盘组织免疫组织化学染色阳性与脐血HBV DNA阳性密切相关。 胎儿组织免疫组织化学染色结果：分别在引产胎儿胎肝和胎肾组织中发现了HBsAg和/或HBcAg阳性细胞。脾脏中也发现HBsAg阳性细胞。HBsAg和HBcAg阳性细胞散在于肝实质中，胎肾中HBsAg阳性细胞散在于肾小管和肾小球细胞。HBcAg阳性细胞见于肾小球细胞。 8．引产胎儿胎肝和胎肾组织HBV DNA检测结果：在2例免疫组织化学染色阳性的引产胎儿肝脏和肾脏中检测到了HBV DNA。 9．在HBV标志物阳性和阴性孕妇胎盘组织中都检测到了凋亡细胞的存在，阳性孕妇胎盘凋亡细胞指数明显高于阴性者。在HBV阳性胎盘中细胞凋亡的数量各不相同。细胞凋亡多见于合体滋养层细胞，胎盘绒毛基质细胞，也可见于胎盘绒毛毛细血管内皮细胞和小血管内皮细胞。凋亡细胞可单个出现，也可成簇出现。凋亡细胞周围组织没有炎症改变。胎盘凋亡细胞的数量与母亲血清HBV DNA水平无明显相关性，但与脐血HBVDNA及胎盘组织HBsAg组化染色结果相关。脐血HBV DNA阴性孕妇胎盘细胞的凋亡数量明显高于阳性孕妇，胎盘细胞HBsAg组化染色阳性孕妇胎盘组织中凋亡细胞数量明显低于组化染色阴性的孕妇。 10.倒置相差显微镜下见原代培养滋养层细胞和JEG-3细胞系与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变，加入感染血清后细胞继续生长，与阴性对照组相比无明显差异。细胞结构无明显改变，细胞间连接未见破坏。 11．细胞免疫荧光染色显示，滋养层细胞与HBV感染血清共同孵育后，滋养层细胞可以出现HBsAg阳性信号，阴性对照组未见HBsAg阳性细胞。在8小时时，阳性信号较弱，感染细胞数量也较少，24小时时阳性信号最强，感染细胞数量也最多，与8小时组比较有显著性差异。之后滋养层细胞中HBsAg阳性细胞数量无明显增多。 12．细胞免疫组织化学染色显示：感染24小时和48小时，滋养层细胞核中可见HBcAg阳性表达。 13．荧光定量PCR检测结果显示，在与HBV感染血清共同孵育8小时、24小时和48小时的原代培养滋养层细胞和滋养层细胞系JEG一3细胞中均检测到HBV DNA的存在。 14．TUNEL染色法检测与HBV感染血清共同孵育的滋养层细胞的凋亡结果显示，与感染血清共同孵育24小时和48小时的滋养层细胞出现凋亡，且随着孵育时间的延长，凋亡细胞数量呈增加趋势。两组间比较有显著性差异。与正常人血清共同孵育的滋养层细胞未见出现明显的凋亡细胞。结论 1．本研究中7对乙肝病毒母婴传播免疫阻断失败母子HBV的基因型为B型和C型。 2．乙型肝炎疫苗阻断乙肝病毒母婴传播免疫失败的原因可能与HBV变异株的感染有关，变异株来源于母亲。 3．“a”决定簇的变异可能影响乙型肝炎病毒的免疫原性，使乙型肝炎疫苗免疫阻断失败。 4．在疫苗和机体免疫压力下，发生HBV母婴传播的儿童体内的病毒可能发生新的变异。 5．母亲HBV DNA高水平是HBV宫内传播和宫内感染的高危因素。脐血HBV DNA阳性并不能确诊HBV的宫内感染，但可作为判断宫内感染的一个相关指标。 6.HBV可能通过胎盘感染的途径由母体进入胎儿体内。胎盘细胞的感染与脐血HBV DNA水平相关。 7.HBV在胎儿组织器官内的定位和复制是诊断HBV宫内感染的证据。 8.胎盘细胞的凋亡可能是胎盘屏障的一种防御机制，对阻断HBV的宫内传播有一定意义。 9.HBV可以感染体外培养的滋养层细胞。在被感染细胞中可以检测到HBV DNA。被感染细胞呈散在分布，细胞形态、结构、及细胞间连接无明显改变。 10.HBV感染可以诱导滋养层细胞凋亡，滋养层细胞的凋亡可能是胎盘屏障阻止HBV宫内感染的一种保护性机制。

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英文缩略语

论文一乙肝疫苗阻断HBV母婴传播免疫失败与母子HBV基因分型及S基因变异的相关性

论文二HBV宫内感染的诊断及HBV宫内传播机制的初步探索

论文三人早孕绒毛膜滋养层细胞的体外培养及鉴定

论文四HBV体外感染人胎盘绒毛膜滋养层细胞的实验研究

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 乙肝病毒母婴传播机制及预防的研究进展

在学期间科研成绩

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