ATP敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及信号转导机制

摘要

缺血性脑血管病是目前严重危害人类健康的疾病，临床上一直把寻找确实有效的脑保护药物作为研究的重点内容。ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂是近年新兴的一种脑保护剂，但其保护作用机制仍不清楚。脑缺血治疗的关键是减轻脑缺血半暗带区的神经元凋亡。细胞内有一套精细复杂的信号系统在调控着凋亡过程。目前认为死亡受体通路和线粒体通路是细胞凋亡的主要信号转导通路，而死亡受体通路和线粒体通路分别以caspase-8和caspase-9的激活为特征，二者再进一步激活下游的caspase-3，最终诱导细胞凋亡。我们的实验观察了KATP通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积、神经功能缺损评分、神经元凋亡及caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA和蛋白表达的影响，探讨KATP通道开放剂对脑缺血再灌注损伤的保护作用及信号转导机制，为临床应用KATP通道开放剂治疗缺血性脑血管病提供了科学的实验依据，具有深远的实际应用意义。 实验方法：选择Wistar雄性大鼠220只随机分为四组：A组(假手术组)、B组(缺血组)、C组(KATP通道开放剂治疗组)及D组(KATP通道开放剂+阻断剂治疗组)。应用改良Nagasawa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型，应用TTC染色观察梗死体积，记录神经功能缺损评分；应用TUNEL法观察神经元凋亡；应用免疫组化、原位杂交、RT-PCR技术研究脑缺血再灌注后caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA及其蛋白的表达，探讨KATP通道开放剂对脑缺血再灌注损伤的保护作用及信号转导机制。所有实验数据以均值±标准差(-x±s)表示。所得数据用SPSS11.5软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。 实验结果：1.脑梗死体积A组未发现有梗死病灶，B、C、D组梗死病灶主要位于右侧额顶叶皮质及尾状核、壳核区域。B、C、D组梗死体积与A组相比均有显著性差异(P＜0.01)。C组梗死体积明显小于B组和D组(P＜0.01)，D组与B组相比无显著性差异(P＞0.05)。 2.神经功能缺损评分B、C、D组神经功能缺损评分与A组相比具有显著性差异(P＜0.01)。C组神经功能缺损较B、D组明显减轻(P＜0.05)，B、D组之间无显著性差异(P＞0.05)。 3.神经元凋亡结果A组仅见少量凋亡细胞，B、C、D组凋亡细胞主要分布于缺血周边区，即缺血半暗带内。凋亡细胞于脑缺血再灌注后6h增多，随时间延长逐渐增多，于脑缺血再灌注后24h凋亡细胞数达到高峰，缺血后48h、72h凋亡细胞数逐渐减少。各组在缺血中心区凋亡细胞表达均较少。B、C、D组各时间点凋亡细胞与A组相比均有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，C组6h时间点凋亡细胞与B、D组相比有下降，但统计学元显著性差异(P＞0.05)，C组其余各时间点凋亡细胞数较B、D组均显著减少(P＜0.01，P＜0.05)。D组各时间点凋亡细胞数与B组相比均无显著性差异(P＞0.05)。 4.免疫组化结果A组仅见少量阳性细胞表达，B、C、D组各时间点caspase-3、caspase-8、caspase-9阳性细胞主要分布于缺血周边区，即半暗带内，缺血中心区内较少表达。B、C、D组caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表达均于脑缺血再灌注后6h开始增加，以后随缺血时间延长，阳性细胞逐渐增多，24h达高峰，以后表达下降。C组仅caspase-8蛋白在6h时间点与B、D组无显著性差异(P＞0.05)，其余各时间点C组的caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表达均显著少于B组和D组(P＜0.01，P＜0.05)，D组各时间点caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表达与B组比较无显著性差异(P＞0.05)。 5.原位杂交结果A组仅见少量阳性细胞表达，B、C、D组caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA的阳性细胞主要分布于缺血周边区内，缺血中心区内较少表达。缺血再灌注后6h阳性细胞表达开始增加，24h达高峰，以后表达下降。C组仅caspase-9mRNA阳性细胞在6h时间点与B，D组相比无显著性差异(P＞0.05)，其余各时间点caspase-3，caspase-8，caspase-9mRNA阳性细胞表达均显著少于B组和D组(P＜0.01，P＜0.05)，D组各时间点阳性细胞表达与B组比较无显著性差异(P＞0.05)。 6.RT-PCR结果A组caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA仅见微弱表达，B、C、D组caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA随脑缺血再灌注时间延长，表达逐渐增强，于缺血再灌注后24h达高峰，以后表达逐渐减弱。C组各时间点caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表达均显著少于B组和D组(P＜0.01)，D组各时间点caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表达与B组比较无显著性差异(P＞0.05)。 结论：1.KATP通道开放剂能显著减少脑缺血再灌注后梗死体积，改善神经功能缺损程度，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。 2.KATP通道开放剂能显著减少脑缺血再灌注后半暗带区的神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。 3.KATP通道开放剂能显著下调脑缺血再灌注后caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA及其蛋白的表达，提示KATP通道开放剂可能通过同时抑制死亡受体途径和线粒体途径来减少脑缺血再灌注后的神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。

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中文论著摘要

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英文缩略语

论文一ATP敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

论文二ATP敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡的保护作用

论文三ATP敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡信号转导通路的影响

结 论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综 述 脑缺血神经元凋亡与KATP通道开放剂的保护作用

在学期间科研成绩

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