应用巢式PCR进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

摘要

目的：探讨孢子丝菌病的分子生物学快速诊断方法。 材料及方法：一、实验材料1.实验菌株：临床分离的申克孢子丝菌38株(其中中国15株，日本n株，美国4株，委内瑞拉3株，阿根廷2株，澳大利亚、南非、法国各1株，mtDNA型1～24均包括其中)。克柔念珠菌、白念珠菌、马尔尼菲青霉、烟曲霉、疣状瓶霉、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、新型隐球菌、须癣毛癣菌、卡氏枝孢霉菌种各1株，均为中国医学科学院皮肤病研究所保存菌株。Ceratocystisminor2株，均为日本Tokyo医学真菌研究所保存菌株。 2.实验动物：10只BALB/c小鼠，实验动物体重22g～24g，8～10W，购自辽宁省实验动物中心。小鼠被分为两组，1组雄性5只，1组雌性5只。 3.临床标本：9个经真菌培养确诊的人孢子丝菌病的病理活检标本来自于本科。 二、实验试剂1.基因组DNA提取主要试剂基因组DNA提取液CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)。 2.PCR主要试剂2.1真菌特异性外层引物SS1和SS22.2真菌特异性内层引物SS3和SS43.动物实验试剂3.1标准菌株ATCC10268申克孢子丝菌菌悬液3.2组织基因组DNA提取液SDS3.3蛋白酶K 三、实验方法1.DNA的提取利用CTAB方法提取来自于不同地区临床分离的申克孢子丝菌38株[含有24个线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)型]及10株其它临床上重要的致病真菌以及2株与申克孢子丝菌相似的真菌(Ceratocystisminor)基因组DNA，调整100ng/μL，其中将ATCC10268DNA浓度稀释为(100ng/μL～0.01pg/μL)以备PCR扩增。 2.动物模型制备：将申克孢子丝菌菌株在沙氏葡萄糖肉汤液态培养基中培养，过滤除去菌丝，然后计数孢子数量，用生理盐水稀释至所需浓度，分别于8只小鼠的尾背4点皮下注射各0.05mL(包含7.5×105cfu)，2只小鼠尾背4点皮下注射0.05mL生理盐水做阴性对照，35d后接种部位局部取材。 3.临床和动物模型组织标本的基因组DNA提取：0.1g的临床组织标本或感染小鼠组织标本加入400μLDNA提取液混匀，55℃过夜，加热至95℃10min以灭活蛋白酶K，再液氮冷冻后加热5个循环，用CTAB法(同上)提取真菌基因组DNA备用。 4.巢氏PCR4.1一层PCR：应用真菌特异性外层引物SS1和SS2对来自于不同地区临床分离的申克孢子丝菌38株(含有24个mtDNA型)及不同浓度的标准菌株ATCC10268的DNA、标准菌株ATCC10268制备的8个动物模型标本、9个临床病理活检标本，10株其它临床上重要的致病真菌以及2株与申克孢子丝菌相似的真菌进行PCR扩增。 4.1.1PCR反应体系：总体积为50μlTaKaRaTaq(1.25U/μl)0.3μl10×PCRbuffer(含mg2+)5μldNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol/L)4μlSS1(20μmol/μL)1μlSS2(20μmol/μL)1μltemplateDNA(100ng/μL)5μl4.1.2PCR反应条件：95℃5min预变性40个循环：95℃1min变性、56℃1min复性、72℃1min延伸，后延伸72℃5min。 4.2电泳PCR产物在质量分数为2％琼脂糖凝胶上电泳观察并照相。 4.3目的片段回收将PCR产物利用PCR产物回收试剂盒对305bp的目的片段进行回收、纯化。 5.巢氏PCR扩增：应用真菌特异性内层引物SS3和SS4对回收DNA，进行PCR扩增。 5.1.1PCR反应体系如下：反应总体积50μlTaKaRaTaq(1.25U/μL)0.3μl10×PCRbuffer(含mg2+)5μldNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol/L)4μlSS3(20μmol/μL)1μlSS4(20μmol/μL)1μltemplateDNA(100ng/μL)5μl5.1.2PCR反应体条件如下：同上。5.2电泳PCR产物在质量分数为2％琼脂糖凝胶上电泳观察并照相。 结果：1.临床分离的38株申克孢子丝菌(含有24个mtDNA型)一次PCR和巢氏PCR均各扩增出一条带型，分别为305bp和152bp片段，其他真菌均为阴性。 2.对不同浓度的标准菌株ATCC10268的DNA进行巢式PCR扩增结果：外层引物PCR在大于或等于5pg时可扩增出305bp片段，而内层巢式PCR在在大于或等50fg时可扩增出152bp片段，敏感度提高100倍。 3.8个动物感染模型以及9个临床已经过真菌培养证明感染申克孢子丝菌的人体活检标本均扩增出152bp的片段。 结论：1.本实验特异性引物结合巢氏PCR具有明显的特异性。 2.实验也对PCR与巢氏PCR敏感性进行了对比研究，说明特异性引物结合巢氏PCR具有高敏感的特点。 3.从病变组织中直接检测孢子丝菌DNA的可能性提供依据，为有效、快速、准确地鉴定申克孢子丝菌提供一种好方法。

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综述 申克孢子丝菌与分子生物学诊断

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