凝血酶对体外培养的家兔虹膜色素上皮细胞的增殖作用的实验研究

摘要

目的：探讨凝血酶对虹膜色素上皮细胞的影响。本实验将研究凝血酶对虹膜色素上皮细胞的生长的增殖作用，为进一步由虹膜色素上皮细胞转分化生成晶状体提供一些实验的依据。 方法： 1、体外培养家兔虹膜色素上皮细胞。 2、对培养的家兔虹膜色素上皮细胞进行免疫组织化学鉴定。 3、利用体外培养的虹膜色素上皮细胞，观察不同浓度的凝血酶对虹膜色素上皮细胞的影响。将虹膜色素上皮细胞接种至96孔培养板，每孔0.2ml，随机分为5组进行实验(1-5组)，1组为对照组，2-5组为实验组，分别加入0.1，0.5，1.0，5.0NU/ml的凝血酶，37℃，5％CO<,2>培养箱中培养48小时。用MTT法测定各孔贴壁细胞数量的吸光度值。 4、根据上一实验的结果，选定0.5NU/ml为实验组加入凝血酶的浓度。将培养的细胞调整浓度，接种至96孔培养板，每孔0.2ml，随机分为两组进行实验，对照组加入0.5NU/ml的凝血酶，实验组加入0.5NU/ml的凝血酶和等量的凝血酶抑制剂，37℃，5％CO<,2>培养箱中培养48小时。用MTT法测定各孔贴壁细胞数量的吸光度值。 5、数据分析用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。结果采用t检验，以P<0.05作为差异有显著意义。 结果： 1、原代IPE细胞核圆，胞浆内充满了黑色的色素颗粒。密集处细胞大多数为多角形或者为方形，稀疏处细胞呈梭形。传代后的细胞形态与原代相似，但随着传代次数的增加细胞体积有所增大，细胞胞浆中的黑色色素颗粒也越来越少。细胞逐渐老化，胞浆界限模糊。 2、细胞免疫组化染色结果几乎所有细胞的胞浆都呈现棕黄色，细胞核呈蓝紫色。 3、不同浓度凝血酶对虹膜色素上皮细胞的作用 MTT法结果显示，凝血酶对体外培养的虹膜色素上皮细胞有增殖作用，具有明显的剂量依赖性，各组与对照组之间比较的差异有统计学意义，随着凝血酶剂量的增加，虹膜色素上皮细胞的增殖作用也增加。 4、凝血酶及其抑制剂对虹膜色素上皮细胞的作用 MTT法结果显示，凝血酶对体外培养的虹膜色素上皮细胞的增殖作用能被凝血酶抑制剂所抑制，并且差异有统计学意义。 讨论： 凝血酶为丝氨酸蛋白酶超家族成员之一，具有酶活性的凝血酶是血浆中凝血酶原经由凝血酶原酶复合物(prothrombinase complex)(凝血因子X a与凝血因子Va结合形成1：1的复合物)催化裂解形成。目前的研究已经发现凝血酶除了参与血液凝固以及血栓形成的作用外还存在着其他的功能，例如：炎症反应，伤口愈合，组织重建，激活生长因子，胚胎发生，以及正常和异常的生长调控。大部分凝血酶在血液中的存在方式是前体形式，即凝血酶原。在伤口处引起血液成分的聚集影响愈合反应。 体外培养虹膜色素上皮细胞在凝血酶的作用下有明显的增殖，而且细胞的增殖对凝血酶具有一定的剂量依赖性。随着凝血酶的浓度的提高，虹膜色素上皮细胞的增殖作用也增强。在白内障手术中，手术刺激使血管的通透性增强以及在手术过程中血一房水屏障的破坏或者削弱都可能使原本在血管内的凝血酶进入眼房水中，参与促进虹膜色素上皮细胞增殖生长的活动。当加入凝血酶抑制剂后，虹膜色素上皮细胞的生长即被抑制。很明显，凝血酶对于虹膜色素上皮细胞的促进其增殖的作用可以通过凝血酶的抑制剂而抑制。但是，我们可以看出虽然凝血酶抑制剂的抑制作用有统计学意义，但是不能完全抑制，也就是说，凝血酶在对虹膜色素上皮细胞的促进增殖的作用中，不单单是本身的直接作用，可能还存在其衍生物或者其他作用，这些额外的作用目前还不了解，尚有待研究。凝血酶对体外培养的虹膜色素上皮细胞具有促进增殖的作用，这为探讨来自虹膜色素上皮细胞的晶状体再生提供了实验依据。

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综述 凝血酶尖晶状体再生中作用的研究进展

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