肺炎支原体P1重组蛋白的提取纯化及其在血清学检测中的初步应用

摘要

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)不仅可以引起肺炎、哮喘等呼吸系统疾病，还可导致多种肺外感染和并发症。由于肺炎支原体分离和体外培养困难而使分离培养法不适用于该病原体感染的诊断。血清学方法和PCR技术虽然是目前检测Mp感染的主要方法，但是传统血清学方法使用Mp全菌体成分做抗原，存在敏感性低，易出现交叉反应等缺点，影响诊断效果；PCR技术存在操作复杂、成本较高及非特异反应等弊端也不适合临床应用。本研究应用基因工程技术制备肺炎支原体特异性重组蛋白抗原，用间接ELISA方法检测肺炎支原体抗体，并与Mp全菌抗原的检测结果进行了比较，考察其在临床诊断方面的应用价值，以期为临床诊断肺炎支原体感染提供新型经济适用的检测方法和试剂。 方法: 1、重组蛋白的提取和纯化pGEX-6P-1-P1，重组克隆株经IPTG诱导，离心收集菌体沉淀后，用B-PERGST融合蛋白纯化试剂盒提取、纯化Mp P1重组蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量与纯度， Western blotting分析其抗原特异性。 2、肺炎支原体菌体抗原的制备Mp FH菌株培养按本实验室常规方法进行，将培养物离心后收集沉淀的菌体，经超声粉碎，获得Mp全菌抗原。 3、间接ELISA检测患者血清中Mp IgG抗体采用方阵滴定法确定抗原最佳工作浓度以重组蛋白做抗原，按照确定的抗原最佳工作浓度包被酶标板，建立间接ELISA法，采用比率法对其结果进行判定。 4、抗原精密度检验及敏感性、特异性检验按上述确定的最佳实验条件对同一份阳性及阴性混合血清重复检测20次，计算OD<,492>值的变异系数(CV)值。将重组蛋白抗原和肺炎支原体全菌抗原分别作为包被抗原，检测51份临床诊断Mp感染患者血清和40份正常献血者血清及6份其他非Mp呼吸道病原体感染阳性血清的IgG抗体。 结果: 1、重组蛋白表达和活性检测结果提取的重组蛋白经SDS-PAGE可见诱导表达的样品在分子量大约59kDa．处有明显条带。免疫印记杂交结果显示，兔抗Mp多价抗体与纯化的重组蛋白在59kDa处形成了特异的抗原抗体反应条带，空白对照没有条带，说明该重组蛋白可被兔抗Mp多价抗体识别，含有肺炎支原体的抗原决定簇。 2、最佳抗原包被浓度结果经方阵滴定法确定了重组蛋白和Mp全抗原的最佳包被浓度分别为1：1000(2.3μg/ml)和1：200(36μg/ml)。 3、精密度检验结果精密度检验表明，本实验由P1重组蛋白建立的间接ELISA方法具有较好的重复性。 4、抗原敏感性及特异性检验结果 (1)敏感性检验51份临床血清标本(日本明胶凝集诊断试剂检测Mp抗体效价1：40~320)由P1重组蛋白抗原检测阳性31份，阳性率为60.78％；Mp检测阳性20份，阳性率为39.22％。经配对X<'2>检验证结果表明，由P1重组蛋白抗原建立的ELISA检测方法检测患者血清特异性抗体的检出率明显高于全Mp抗原的检出率，两者差异性具有统计学意义(P<0.05)。 (2)特异性检验用上述的重组蛋白和全Mp抗原ELISA法对40份正常献血者和6份非Mp呼吸道病原体感染者的血清进行了检验，结果均为阴性，表明该重组蛋白具有肺炎支原体抗原特异性，可用做诊断抗原。 结论: 1、用Mp P1重组蛋白抗原建立的ELISA检测方法，其敏感性高于Mp全菌抗原，可用于临床Mp感染的辅助诊断。 2、P1重组蛋白可通过基因工程技术大量制备，故成本较低，并使其检测趋向于标准化，可用于Mp免疫诊断试剂盒的制备。

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·综述·肺炎支原体感染临床检测方法的研究进展

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