Rho激酶在醛固酮肾脏损伤中的作用

摘要

慢性肾脏病(CKD)是危害人类健康的主要疾患之一。探讨影响CKD进展的因素并寻找延缓或阻断其进展的新策略至关重要。 近年来研究发现，醛固酮与高血压、脏器纤维化等病变密切相关。关于醛固酮的多方面、多层次研究仍然方兴未艾。大量的动物实验和临床研究证明醛固酮作为一个独立的危险因素参与肾脏纤维化的过程，是CKD进展的一个关键因子。但是人们对醛固酮与肾脏纤维化关系的认识只是初步的，其确切的机制并未完全明了。 Rho激酶，作为小G蛋白Rho的一个效应因子，能促进细胞应力纤维和黏附斑的形成，调节肌动蛋白细胞骨架的聚合，从而介导包括平滑肌收缩、细胞与基质及细胞与细胞间粘附、细胞迁移、增生、分化、有丝分裂等与肾脏损伤相关的细胞功能。已在多种肾损伤动物模型通过抑制Rho激酶减轻了肾脏损伤而不依赖于血压变化。近来有研究发现Dah1盐敏感高血压大鼠其肾损伤的严重性与肾组织高Rho激酶mRNA水平及肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化增多有关，而且特异性盐皮质激素受体拮抗剂eplerenone阻滞了MLC磷酸化同时改善了肾损伤。这表明醛固酮/Rho激酶通路在介导Dah1盐敏感高血压大鼠肾损伤中的重要作用，但是目前还没有直接的证据证明Rho激酶在醛固酮肾损伤发生中的作用。 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是已被证明的致炎症及纤维化因子。而且有研究表明在醛固酮/氯化钠诱导的肾损伤模型存在肾内AngⅡ高表达，且AngⅡ是Rho/Rho激酶通路激活的主要因子，但目前尚没有在醛固酮肾损伤模型Rho激酶和AngⅡ之间关系方面的研究报道。 目的： 本研究利用单肾切除/醛固酮/氯化钠肾损伤模型，给予Rho激酶抑制剂fasudil长期干预治疗，观察Rho激酶是否参与醛固酮/氯化钠诱导的肾脏损伤，以及Rho激酶抑制能否有独立于血压下降之外的肾脏保护作用；并研究致纤维化信号通路TGF-β1-Smad-CTGF是否介导了醛固酮肾损伤作用，以及AngⅡ在此损伤模型中的角色及与Rho激酶相互关系，从而为临床寻找新的降低蛋白尿和延缓肾功能下降的治疗途径提供理论和实验依据。 方法：健康雄性5周龄SD大鼠在实验初始行右肾切除，手术后2周给予1％氯化钠饮水。随机将大鼠分三组：1、对照组(2％酒精皮下泵入，n=9)；2、醛固酮组(醛固酮0.75ug/kg皮下泵入，n=9)；3、醛固酮+fasudil组(醛固酮0.75u/kg；皮下泵入+fasudil 10mg/kg.day。皮下注射，n=8)。其中醛固酮和酒精均采用渗透微泵置于肩胛间皮下泵入，每两周在苯巴比妥麻醉(50mg/kg腹腔注射)下更换渗透微泵。共治疗5周。每周测定体重；分别在治疗0周，1周，3周，5周末测定清醒状态下收缩压，然后把大鼠放入代谢笼收集24小时尿液；尿蛋白测定及血浆、尿液肌酐测定分别采用试剂盒；血浆及肾组织标本在5周末处死前收集；肾组织行PAS和Masson染色观察组织学改变；放免法测定肾皮质AngⅡ含量；westernblot法观察肾皮质磷酸化MYPTl(代表Rho激酶活性)、磷酸化Smad2/3和血管紧张素转化酶(ACE)蛋白表达； real-time PCR法检测肾皮质转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ mRNA表达。 结果： 1、与对照组比较，醛固酮/盐长期灌注使单肾切除大鼠体重明显减轻(430±10g vs 522±8g，P≤0.05)，肾脏重量及肾重/体重的比率增加(分别为5.74±0.23g vs 2.97±0.14g，P<0.05； 1.32±0.08％vs 0.52±0.03％，JP≤0.05)。醛固酮组和fasudil治疗组大鼠体重无显著差别。fasudil治疗使肾脏重量及肾重/体重的比率明显减少(分别为4.75±0.34g及0.97±0.07％，与醛固酮组比较差异显著，P≤0.05)。与对照组比较，醛固酮/1％氯化钠应用5周还降低了单肾切除大鼠肌酐清除率(0.26±0.01 m1.min.g1 kidney wt vs 0.58±0.04m1.min.gq kidney wt，P≤0.05)，并且使血浆肌酐水平升高(0.73±0.09mg.d11vs0.59±0.01 mg.dl，P≤0.05)。Fasudil治疗明显改善了肌酐清除率的变化(0.35±0.02 m1.min～g1 kidney wt)，并使血浆肌酐水平下降(0.60±0.02mg.d1-1)，与醛固酮组比较差异显著(P≤0.05)。 2、三组单肾切除大鼠在治疗前收缩压和尿蛋白排泄无差异。1％氯化钠进饮5周使得收缩压轻微升高(130±4mmHg，5周VS 117±2mmHg，0周，P≤0.05)，同时伴有尿蛋白排泄稍微增加(22±3 mg.24h-1，5周VS 5±2 mg.24h-1，0周，P≤0.05)。醛固酮/1％氯化钠灌注使得大鼠收缩压随时间渐进升高，5周末达到193±3 mmHg，同时，尿蛋白量显著增加(362±93 mg.24h-1 VS 22±3mg.24h-1。P≤0.05)。Fasudil治疗5周未能使收缩压降低(191±9mmHg)，却明显减少了尿蛋白排出(362±93 mg.24h-1 VS 96±22mg.24h-1，P≤0.05)。 3、与对照组比较，醛固酮组大鼠和fasudil治疗组大鼠5周末肾皮质AngII水平显著增高(分别为154±16pmol.g-1，148±11pmol.g-1 VS 81±8pmol.g-1，P≤0.05)，fasudil治疗对其无影响。 4、对照组单肾切除大鼠基本上表现为正常的肾小球和肾小管间质；醛固酮组大鼠表现为严重的肾小球内细胞增生和硬化，有的肾小球表现为纤维素样坏死，肾小管明显扩张，有的小管萎缩，蛋白管型增加，严重间质纤维化，大量炎细胞浸润，肾小球增生指数和肾间质纤维化指数明显增高(分别为3.24±0.50 VS 0.79±0.18，P≤0.05；2.72±0.26 VS 0.43±0.15，P≤0.05)。Fasudil治疗使上述改变明显减轻(分别为1.88±0.52和1.17±0.39)，且差异显著(P≤0.05)。 5、Western blot条带分析显示，与对照组相比，醛固酮持续泵入诱使肾皮质磷酸化MYPT1、磷酸化Smad2/3和ACE蛋白表达明显增加(分别为5.46±0.70 VS1.00±0.23，P≤0.05；4.88±0.24 VS 1.00±0.18，P≤0.05：3.01±0.75 VS 1.00±0.42，P≤0.05)。Fasudil干预治疗明显减少了前二者的磷酸化表达(分别为1.63±0.20和1.98±0.15，P≤0.05)，但ACE表达(2.95±0.65)无变化。 6、与对照组比较，醛固酮组肾皮质TGFβ1、CTGF、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ mRNA的表达明显增加(分别为2.64±0.10 VS 1.00±0.05，P≤0.05：3.23±0.20 VS1.00±0.18，P≤0.05；3.86±0.20 VS 1.00±0.04，P≤0.05；2.63±0.14 VS 1.00±0.04，P≤0.05)。Fasudil治疗使上述靶基因mRNA表达显著降低(分别为1.74±0.22、2.34±0.26、2.42±0.41和1.94±0.27)，与醛固酮组比较差异显著(P≤0.05)。 结论： 1、在醛固酮/盐持续作用下，单肾切除的SD大鼠出现蛋白尿及肾脏纤维化的同时伴有Rho激酶活性增强，抑制Rho激酶活性明显减轻了蛋白尿及肾脏纤维化，说明Rho激酶直接参与了醛固酮/盐持续灌注SD大鼠的肾脏损伤； 2、单肾切除的SD大鼠，醛固酮/盐持续作用诱导肾脏纤维化的同时，伴有肾皮质TGF-β1、CTGF mRNA及Smad2/3蛋白高表达，Rho激酶抑制减轻了上述基因及蛋白的表达，说明在醛固酮/盐持续灌注SD大鼠的肾脏纤维化过程中，TGF-β1-Smad2/3-CTGF信号通路参与并介导了Rho激酶的肾损伤作用； 3、fasudil通过抑制Rho激酶活性，在没有影响血压的情况下减轻了醛固酮/盐诱导的肾脏损伤，说明其有不依赖于降压作用的肾脏保护作用； 4、在醛固酮/盐诱导的肾脏损伤模型中，肾皮质AngⅡ水平增高，同时伴有ACE高表达，说明高AngⅡ水平可能来源于ACE高表达； 5、Rho激酶抑制减轻了肾脏损伤，却未能降低AngⅡ水平及ACE高表达，说明在醛固酮/盐诱导的肾脏损伤模型中，高水平AngII部分通过激活Rho激酶途径参与肾脏损伤，为醛固酮肾损伤提供了一个新的治疗靶点。

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前言

论文一Rho激酶和TGF-β通路在醛固酮肾脏损伤中的作用

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结果

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结论

论文二血管紧张素Ⅱ及Rho激酶在醛固酮肾脏损伤中的作用

前言

材料和方法

结果

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Rho/Rho激酶通路与肾脏纤维化

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